LPS诱导RAW264.7细胞内HMGB1转位及释放实验研究
【摘要】 目的：观察LPS诱导RAW264.7细胞内HMGB1转位及其释放。方法：用不同浓度的LPS处理小鼠RAW264.7细胞20 h，用荧光显微镜观察LPS诱导RAW264.7细胞HMGB1的分布情况。用Western blot方法检测HMGB1在胞核及培养上清中的水平。结果：LPS处理小鼠RAW264.7细胞20 h后，培养上清中的HMGB1水平明显增加，胞核HMGB1含量减少，并存在剂量依赖关系。结论：LPS能诱导RAW264.7细胞释放HMGB1，存在剂量依赖关系。
【关键词】 LPS RAW264.7细胞 HMGB1转位和释放
Abstract Objective：The purpose of this study was to investigate the translocation and release of HMGB1 in LPS-induced RAW264.7 cell. Methods:RAW264.7 cells were incubated with different concentrations LPS for 20 hours, the distribution and levels of HMGB1 in RAW264.7 cells were subsequently analyzed by immunofluorence and Western blot,respectively.Results:HMGB1 accumulation in the culture media of LPS-induced RAW264.7 cells was significantly increased, and the accumulation of HMGB1 in the nucleus was remarkably reduced. Conclusion: LPS can induce significant release of HMGB1 in RAW264.7 cells in a dose-dependent manner.
Key words LPS;RAW264.7 cells; HMGB1 Translocation and release
以往研究表明，内毒素可刺激TNF-α、IL-1等早期细胞因子的合成和释放，被认为是动物多器官功能损害和死亡的核心因子。但抗TNF-α抗体脓毒症的临床研究并未取得预期效果。新近研究发现，巨噬细胞可以产生一种新的细胞因子—高迁移率组蛋白B1（high mobility group box-1 protein，HMGB1）。该细胞因子具有释放晚、持续时间长的特点，被认为是引发机体炎症级联反应的重要介质。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革兰氏阴性杆菌的主要致病成份，本实验重点探讨LPS对RAW264.7细胞内HMGB1转位及其释放的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
RAW264.7细胞由上海细胞生物所细胞库提供；RPMI 1640培养基购自美国GIBCO公司；新生牛血清购自杭州四季青生物制品公司；荧光免疫分析试剂盒购自苏州新波生物技术有限公司。
1.2. RAW264.7细胞的培养
复苏后的RAW264.7细胞置于含100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素、10%新生牛血清、2 mol/L谷氨酰胺的RPMI 1640培养液中培养。37 ℃ 5%CO2孵箱培养，待细胞铺满80%后以0.25%酶、0.02% EDTA 消化，传代培养4次以后（达对数生长期）调整细胞浓度为4×105/L（用于免疫荧光）或4×106/L（用于提取蛋白质），转种于放置了无菌处理盖玻片的6孔细胞培养板中，置37 ℃5% CO2孵箱培养，细胞单层融合达80%后，换无血清的RPMI 1640培养液，孵育2 h用于实验。
1.3. LPS诱导RAW264.7细胞HMGB1转位实验
以50 ng/mL、100 ng/mL、150 ng/mL、250 ng/mL 500 ng/mL不同剂量的LPS刺激，均于刺激20 h后，取出培养孔内载玻片，进行免疫荧光实验，显微镜下观察并拍照。
1.4 细胞活性鉴定
台盼蓝拒染实验：将刺激后的细胞用EDTA消化后吹打成单细胞悬液，取0.5 mL 0.4%的台盼蓝染液、0.3 mL HBSS和0.2 mL细胞悬液，充分混匀。用毛细吸管吸取少量混合液，注入血细胞计数板小室，计数其中着色的细胞。
1.5. HMGB1蛋白的表达测定
Western blot方法测定： 上样量为30 μg将待测样品与一倍量上样缓冲液混匀，封口，放在微量加热器中95 ℃加热5 min后，放置于冰上直至加样。各样品在15%的聚丙稀酰胺凝胶中电泳，并电转移至硝酸纤维素膜上。5%脱脂奶粉封闭过夜后，加入1∶1 000稀释的小鼠抗人的HMGB1单克隆抗体，4 ℃过夜，TBS洗膜后，加入1∶1 000稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗鼠抗体，室温孵育2 h，TBS洗膜后，BCIP/NBT显色，当特异性蛋白带颜色不再加深后，终止反应。对照样品30KD显色条带强弱，用Image-Pro Plus 5.0图像分析系统分析，测定各样品的总光密度值(Integrated Optical Density，IOD)。根据标准品光密度值换算出相关的HMGB1含量。
1.6 统计学处理
采用SPSS 12.0软件包分析，计量资料以均数±标准差表示，两样本均数比较采用t检验，P<0.05为差异有显著性。
2 结果
2.1. LPS刺激RAW264.7细胞后核内HMGB1向胞浆转移
LPS刺激RAW264.7细胞20 h后结果显示：刺激RAW264.7细胞核内HMGB1向胞浆转移； 以500 ng/mL LPS组较为明显，荧光镜下可见细胞核内HMGB1几乎完全转移至细胞浆中（见图1）。
2.2. LPS对HMGB1蛋白的影响
采用Western blot方法检测不同剂量LPS刺激RAW264.7细胞中HMGB1的表达结果显示：刺激前RAW264.7细胞中HMGB1主要存在细胞核中，上清中几乎没有HMGB1；随着LPS剂量增加，细胞核中的HMGB1蛋白水平越来越少，而上清中HMGB1水平是越来越多（见图2，图3）。
3 讨论
HMGB1是真核细胞核内一类含量丰富的非组蛋白染色质蛋白，作为核DNA结合蛋白参与稳定染色质结构与功能和基因转录调控，HMGB1具有两个同源的DNA结合区域即HMG A box和B box［1］。近期发现，细胞外HMGB1是内毒素血症和脓毒症的一种晚期细胞因子。但由于HMGB1基因缺陷动物（HMGB1-/-）在出生后几天内很快死亡，没有绝对的阴性对照动物，因此关于HMGB1体内诱导表达释放的研究，目前还比较困难。国内外关于HMGB1致炎作用中的表达释放的研究，除了用动物造模以及体外细胞培养加刺激方法，观察HMGB1表达和释放的变化外，还检测了各种病理状态下体内HMGB1的表达和释放水平。目前比较公认的HMGB1致炎作用反应是由LPS刺激巨噬细胞表达和释放［2～4］。但对其影响因素和机制尚未完全清楚。为了进一步探讨巨噬细胞对HMGB1的表达和释放机制，给针对HMGB1靶点的临床实验提供依据，我们观察了体外培养的小鼠RAW264.7细胞株接受不同剂量LPS刺激后，对HMGB1的释放过程。结果显示：RAW264.7细胞接受LPS刺激后活化和释放HMGB1存在剂量依赖关系。较大剂量的LPS（500 ng/mL）能明显增加细胞的活化率，并增加HMGB1的释放量。在刺激20 h后，原来存在于细胞核中的HMGB1几乎全部转位到胞浆中。这与以往研究所报道的巨噬细胞被激活后，首先将储于细胞池中的HMGB1释放，36 h后释放增强表达的HMGB1的结果相一致［2］。巨噬细胞是机体重要免疫应答细胞之一，这一特性进一步提示它在炎症反应中的重要性。
与TNF-α、IL-1等炎症因子相比，HMGB1释放时间延迟和持续时间长的动力学特点，因此HMGB1被认为是目前较为理想的临床干预窗口和靶点。本实验的研究结果为以后研究HMGB1在各种炎症疾病中尤其是肝病中的作用提供一定的理论基础。
【文献】
［1］ Ferrari S.Finelli P，Rocchi M，et al.The active gene that encodes human high mobility group 1 protein (HMG1) contains introns and maps to chromosome 13. Genomics,1996,35(6):367～371.
［2］ Wang, H.,Bloom, O.,Zhang,M.,et al. HMG-1 as a late mediator of endotoxin lethality in mice. Science，1999，285(5 425):248～251.
［3］ Andersson U, Wang H, Palmblad K, et al. High mobility group 1 protein (HMG-1) stimulates proinflammatory cytokine synthesis in human monocytes.J Exp Med，2000，192(4):565～570.
［4］ Czura CJ, Tracey KJ. Targeting high mobility group box 1 as a late-acting mediator of inflammation. Crit Care Med，2003，31(1):46～50.
