拉米夫定治疗CHB患者YMDD基因型耐药检测

             作者：杨柳絮 赵中夫 韩红莉   

【摘要】  目的：检测拉米夫定(LVD)抗HBV过程中YMDD变异出现的时间和频率。方法：35例慢性乙型肝炎患者入选，接受LVD治疗，100 mg/d，疗程52周。分别在治疗前及治疗后12周，20周，24周，36周和52周检测YMDD变异、HBV DNA、ALT和HBV M。结果：20周有1例出现YMDD变异，24周有2例YMDD变异，36周有4例YMDD变异，52周有5例YMDD变异；52周后，HBV DNA转阴率为74.3%(26/35)，ALT复常率为71.4%(25/35)，HBeAg转阴率为42.9% (15/35)。结论：LVD治疗20周前，换用或联合另一种有效的核苷（酸）类似物，可有效预防YMDD耐药的出现。

【关键词】  YMDD变异 米夫定 慢性乙型肝炎

    Abstract  Objective:To determine the time of LVD-resistance during the antiviral therapy in patients with chronic hepatitis B.Methods:Thirty-five patients with chronic hepatitis B were enrolled.They received lamivudine(LVD)100 mg/d for 52 weeks.Serum HBV DNA,alanine aminotransferase(ALT),HBV M and YMDD were measured at 0wk,12wk,20wk,24wk,36wk and 52wk of LVD treatment.Results:One patient emerged YMDD mutation at week 20 of LVD treatment,there are 2 patients and 4 patients at week 24 and 36,respectively,at week 52,5 patients emerged YMDD mutation,the rates of undetectable HBV DNA,ALT normalization and HBeAg loss are 74.3%,71.4% and 42.9%.Conclusion:The ideal treatment is that receiving LVD for 20 weeks,then switch to another drug in order to prevent YMDD mutation during the antiviral therapy.

    Key words  YMDD mutation;Lamivudine;Chronic Hepatitis B

    核苷（酸）类似物的出现为慢性乙型肝炎(Chronic Hepatitis B,CHB)的治疗打开了新局面，已成为临床上抗HBV治疗的重要手段，其中拉米夫定（LVD）上市最早，临床上应用也最为广泛。它服用方便、安全，具有较强抑制病毒的作用，能显著降低HBV DNA水平，并可使ALT复常，肝组织学显著改善，延缓肝炎疾病的进展和减少肝癌的发生率［１］。但长期应用易致HBV多聚酶结构域的YMDD基序发生变异，导致治疗失败［２］。有报道YMDD变异的发生与用药时间呈正相关。

    虽然LVD发生耐药与用药时间密切相关，但是关于YMDD基因型耐药出现的最早时间尚未完全确定。本试验以初治CHB患者为研究对象，观察LVD治疗CHB患者的疗效，采用PCR-RFLP方法在治疗不同时间点检测YMDD变异，以此确定YMDD基因型耐药出现的最早时间。

    1  对象与方法

    1.1  研究对象

    1.1.1  病例选择、排除标准：收集2003年1月～2003年6月在我院门诊和病房治疗的CHB患者35例。全部符合2000年西安会议制定的CHB慢性乙型肝炎的诊断标准［３］，所有入选对象均签署治疗知情同意书。①年龄:18岁～65岁间，性别不限;②HBV血清标志物:HBsAg阳性超过6个月,血清HBV DNA≥104拷贝/mL;③筛选前6个月内曾有血清丙氨酸转氨酸(ALT)≥2倍正常值(ULN)，且在入选时血清ALT>1×ULN。④入选前半年内未用过a-干扰素、核苷类抗HBV药物、胸腺肽或其它具有抗HBV作用的药物。筛选时有以下任一条件者排除：①抗HCV、HDV、HIV阳性，患自身免疫性肝炎（抗核抗体滴度>１∶160）；②血清肌酐>1.5 mg/dL (≥133 μmol/L);③入选时患者ALT>10×ULN，或急性病情加重导致一过性肝脏失代偿；④患其他严重器质性疾病、计划接受肝移植或已进行过肝移植；⑤妊娠或哺乳期妇女。

    1.1.2  治疗方法：35例患者中，男31例，女4例，HBeAg阳性39例，阴性6例。给予LVD 100 mg/d，在治疗前及治疗后12周，20周，24周，36周和52周检测HBV DNA、ALT、HBV M和YMDD变异。疗程52周。LVD片剂100 mg/片，由葛兰素史克医药公司生产，批号不同。

    1.2  PCR-RFLP检测YMDD变异

    采用PCR-RFLP方法检测YMDD变异株，引物由上海生物工程公司合成，限制性内切酶购自上海生物工程公司，为美国Promega公司产品。HBV YIDD变异检测试剂盒与HBV YVDD变异检测试剂盒由北京大学肝病研究所肝炎试剂研究中心提供。

    1.2.1  HBV DNA的提取：取10 μL血清加入50 μL裂解液混匀，94 ℃10 min热浴，12 000 rpm离心3 min,弃上清液留沉淀。

    1.2.2  HBV P基因PCR扩增：以提取的HBV DNA为模板,在反应管内加入PCR反应液30 μL,石蜡油1滴,分别采用P3,P4引物(针对YVDD变异)和P5,P2引物(针对YIDD变异)按以下条件进行HBV DNA P基因的PCR扩增:先94 ℃300 s,然后94 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃45 s,一共35个循环。表1  PCR反应引物序列