上皮性卵巢癌中Skp2蛋白的表达及临床意义
作者：刘云春 魏荣英 李建平
【摘要】 目的:探讨Skp2蛋白表达与上皮性卵巢癌发生、及预后评价的意义。方法：采用免疫组化法检测15例卵巢上皮性良性肿瘤、10例卵巢上皮性交界性肿瘤及58例上皮性卵巢癌中Skp2蛋白的表达情况。结果：Skp2在卵巢上皮性良性及交界性肿瘤中的表达均为阴性，而在上皮性卵巢癌中高表达，阳性率为4828%(28/58),Skp2在中低分化组、Ⅲ/Ⅳ期组及有淋巴结转移组分别高于高分化组（Ｐ＜001)、Ⅰ/Ⅱ期组 （Ｐ＜001)及无淋巴结转移组（Ｐ＜001)。在不同年龄及组织类型的卵巢癌中表达无显著性差异。结论：Skp2在上皮性卵巢癌中表达，表达水平越高提示预后越差。
【关键词】 卵巢癌；Skp2；临床分期；病理分级；预后
【ABSTRACT】 Objective：To investigate expression of Skp2 protein in ovarian epithelial tumors and its clinical significance. Methods:Test ovarian epithelian tumor tissues of 83 cases with monoclonal antibody Skp2 by immunohistochemistry.Results: The rate of positive expression of Skp2 was 4828% in ovarian epithelial cancers.No expression of gene protein appeared in borderline and benign ovarian tumor tissues.Conclusion: Skp2 gene participate in origination and development of ovarian epithelial cancers, and higher expression of Skp2 indicats worse prognosis.
【KEY WORDS】 Ovarian cancer；Skp2;Pathological grade；Clinical stage;Prognosis
随着分子生物学的发展，对肿瘤的发生有了新的认识，肿瘤是一种细胞周期调控异常性疾病，细胞周期主要由细胞周期素（cyclin）及细胞周期素依赖性激酶（CDK）形成的蛋白质复合物进行调节，肿瘤相关基因通过对其某个环节进行调控，使细胞异常增殖而发生肿瘤。S期激酶相关蛋白Skp2(Sphase kinase asso
ciated protein 2，Skp2)是新近发现的一种癌基因，是对细胞周期调控具有重要作用的蛋白之一，与肿瘤的发生关系密切。本文用免疫组化方法检测Skp2蛋白在卵巢上皮性肿瘤组织的表达水平,探讨其在卵巢上皮性肿瘤的发生、发展过程中的作用，以及预后估计的意义。
1 资料与方法
11 一般资料
收集19995～20053月河北北方学院附属第一手术切除的卵巢上皮性肿瘤标本存档蜡块并经病理确诊共83例。年龄22～76岁，平均475岁,年龄中位数52岁。所有病例均为原发性卵巢上皮性肿瘤，术前未做过任何化疗和放疗。其中，良性卵巢肿瘤15例（卵巢浆液性囊腺瘤8例，粘液性囊腺瘤7例），交界性肿瘤10例（交界性浆液性囊腺瘤5例，交界性粘液性囊腺瘤5例），上皮性卵巢癌58例（卵巢浆液性囊腺癌25例，卵巢粘液性囊腺癌18例，子宫内膜样癌15例）。根据术中所见，卵巢癌的临床分期按照国际妇产科联盟（FIGO，1985）分期：Ⅰ期8例，Ⅱ期11例，Ⅲ期20例，Ⅳ期19例；按照WHO分化标准：高分化20例，中分化22例，低分化16例；有淋巴结转移15例，无淋巴结转移43例。
12 方法
采用免疫组化SP法,一抗为兔抗人Skp2蛋白多克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology公司),稀释1∶50为工作液，SP试剂盒和DAB为北京中山生物技术公司产品。手术标本均经10%福尔马林固定，常规石蜡包埋，3um厚连续切片，贴于涂有多聚赖氨酸的载玻片上。切片染色前常规脱蜡、水化，修复抗原，03%H2O2溶液阻断内源性的过氧化物酶，全部操作过程按SP试剂盒说明书完成。用已知的阳性切片作为阳性对照，用PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。
13 结果判定标准
Skp2阳性表达部位主要位于卵巢上皮细胞的细胞核内，胞浆也有少量着色，呈棕黄色，随机观察10个高倍视野并计数，每个视野至少计数100个细胞，取其平均值为该病例的细胞阳性率，Skp2阳性细胞率＜25%为阴性（-），25%～50%为阳性（+），＞50%为强阳性（++）。
14 统计学方法
采用SPSS110统计软件对数据进行统计学处理,应用Fishers精确检验及χ2检验。
2 结果
21 Skp2在卵巢上皮性肿瘤中的表达
Skp2蛋白在卵巢上皮性肿瘤和交界性肿瘤中表达阴性，在上皮性卵巢癌中的阳性率为4828%，表达明显高于良性肿瘤组(Ｐ＜001)和交界性肿瘤组（Ｐ＜001)，见表1。表1 Skp2蛋白在卵巢上皮性肿瘤中的表达表2 Skp2在卵巢癌中的表达及临床病理特征
22 Skp2在上皮性卵巢癌中的表达水平及临床病理特征
在上皮性卵巢癌中，Skp2蛋白在不同年龄及组织类型组中表达无显著差异（P＞005），而不同的临床分期、组织分化及淋巴结转移组中，Ⅲ/Ⅳ组、中低分化组及有淋巴结转移组分别明显高于Ⅰ/Ⅱ期组（Ｐ＜001）、高分化组（Ｐ＜001）及无淋巴结转移组（Ｐ＜001），见表2。
3 讨论
Skp2是由Zhang等[1]1995年从人成纤维细胞中首次克隆，发现细胞内注入Skp2抗体或反义寡核苷酸能阻断它的功能，阻止细胞进入S期。其基因定位于人染色体5p13,相对分子量48928，由435个氨基酸构成[2]。Skp2是正常或异常细胞进入S期所必需的，Skp2在细胞周期中首先在G1/S期出现，在S/G2期升高。在细胞周期中主要通过泛酸依赖性蛋白水解途径参与细胞周期的调控。泛酸蛋白酶体途径是真核细胞中的一种蛋白降解途径，主要通过降解细胞内泛酸化的蛋白质[3]。泛素经过泛素活化酶E1、泛素结合酶E2及泛素结合酶E3等一系列催化步骤结合底物蛋白，形成泛素-底物蛋白复合体，使底物进入26S蛋白酶体内实现泛素化降解。泛素连接酶复合物SCF(Skp1CullinFbox)的Fbox亚基能特异性识别底物并与之结合，使之进入泛素化降解。Skp2是Fbox蛋白家族成员之一，是泛素蛋白连接酶E3中的一种。Skp2的主要功能是作为SCF复合物的底物识别亚基，特异性识别磷酸化的底物并介导其泛酸化降解。目前发现许多细胞周期调控因子：CyclinD1,E2F,P27,P53,cyclinB等都是泛酸蛋白酶体途径的底物。P27是细胞周期依赖性激酶抑制物中的一种，Skp2在P27的泛酸蛋白酶水解途径中为限速成分，Skp2通过介导肿瘤抑制物P27的泛素化蛋白水解使肿瘤异常增生。Minamishima等[4]敲除小鼠Skp2基因后行部分肝切除，结果发现，p27表达增加，肝细胞以细胞体积增大、多倍体细胞数量增多为主，不发生细胞数量的增多。Pagano等[5]研究证明，p27缺乏能完全改变Skp2发生畸变的小鼠细胞周期受抑的表现，表明p27是Skp2的泛素连接酶主要的下游效应物。Li等[6]认为p27作为一种肿瘤抑制因子，其被蛋白酶体降解，这一过程是CDK2介导的p27第187位苏氨酸磷酸化，随之于Skp1CullinFboxprotein／Skp2泛素连接酶相互作用。
有研究表明，Skp2具有癌基因的功能。在乳腺癌、胃癌、结直肠癌、前列腺癌、恶性淋巴瘤、肺癌、口腔鳞状细胞癌等多种恶性肿瘤中Skp2表达增加,同时提示肿瘤恶性程度高和预后不良。卵巢癌是女性生殖系统中死亡率最高的恶性肿瘤，为检测Skp2在卵巢上皮性肿瘤中的表达，探明Skp2表达水平与患者生存率间的关系，Shigemasa等[7]利用免疫组化法检测134例卵巢上皮性肿瘤(20例腺瘤、23例低度恶性肿瘤、91例腺癌)。结果显示，其蛋白表达与临床病理类型、总体生存率有关。Shigemasa等应用PCR的方法检测32例卵巢腺癌和3例卵巢癌细胞系中的Skp2mRNA的表达，研究发现,在卵巢腺瘤和潜在恶性病变中几乎缺如。Skp2表达仅在473％的腺癌中有表达。Logrank检验显示Skp2过度表达与患者的预后不良有关。Shigemasa等认为，在卵巢腺癌的发生、过程中Skp2的表达扮演着重要角色。Skp2的过表达是一个评价卵巢腺癌预后的独立因素。本研究显示，Skp2在卵巢癌特异性高表达，且与临床分期、组织分级及淋巴结转移相关，提示其在卵巢癌的发生发展中可能为晚期事件。Skp2的表达水平越高，提示预后越差。
卵巢癌是最致命的妇科恶性肿瘤，由于早期诊断困难，恶性程度高，使患者的生存率低下。Skp2作为一种细胞周期的调控元件，与肿瘤的发生、发展及恶性程度有关，其在卵巢腺癌表达升高，有助于卵巢腺癌的预后估计。目前对其作用仍不完全清楚，Skp2基因在卵巢癌的诊断、和预后等方面的作用还有待于进一步的研究。
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5 Pagano M.Control of DNA synthesis and mitosis by the Skp2p27Cdk1/2 axis［J］.Mol Cell,2004,14(4):414416
6 Li P,Zhao X.p27(Kinl)stabization and G(1)arrest by 1,25dihydroxyvitamin D(3)in Ovarian cancer cells mediated through dowm Regulation of cyclin E/cyclindependent kinase 2 and Shp1Cullinfbox proteinSkp2 ubiquitin ligase［J］.J Biol Chem,2004,279(24):2526025267
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