72例喉癌患者耐药基因与临床预后关系的初步探讨
作者：张青俊 张凡 徐国刚 尚小领 张九龄
【摘要】 目的:探讨喉癌患者中耐药基因P糖蛋白（Pgp），谷胱苷肽Ｓ转移酶(GSTπ)，DNA拓扑异构酶Ⅱ（TopoⅡ），胸苷酸合成酶（TS）表达的临床意义。方法：用免疫组化方法检测72例喉癌组织中的Pgp、GSTπ、TopoⅡ和TS，分析其与临床病理资料及预后的相关性。结果：72例喉癌患者中，Pgp阳性66例、GSTπ阳性50例、TopoⅡ阳性28例、TS阳性12例。Pgp的表达与病理分型、临床分期、淋巴转移及局部复发均相关，GSTπ、TopoⅡ的表达与淋巴结转移相关，TS的表达与各项指标均无明显相关性。患者的病理分级、临床分期、术后是否复发及GSTπ的表达均与术后生存时间明显相关。结论：喉癌患者Pgp、TopoⅡ、GSTπ、TS的联合检测十分必要，病理分级、临床分期、术后复发及GSTπ可以作为判断喉癌患者预后的指标。【关键词】 喉癌；多药耐药；免疫组化；预后
【ABSTRACT】 Objective：To study the relationship between the expression of pglycoprotein(pgp),glutathionestranferaseπ(GSTπ),topoisomerase Ⅱ（TopoⅡ） and themidylate synthase（TS）and the clinical pathological characteristics of the patients with laryngeal squamous cell carcinoma.Methods:The expressions of pgp、GSTπ、TopoⅡ、TS proteins were detected by immunohistochemistry method in 72 patiens with laryngeal squamous cell carcinoma who were followed up more than five years.Results:The expression of pgp was associated with histological grading、UICC staging、lymph node metastasis and recurrence; The expression of GSTπand TopoⅡwas associated with lymph node metastasis; survival rate was correlated with histological grading、UICC staging、recurrence and GSTπ.Conclusion: Histological grading、UICC staging、recurrence and the expression of GSTπcan be redarded as progonosis facters in laryngeal carcinoma.
【KEY WORDS】 Laryngeal carcinoma；Drug resistance; Immunohistochemistry ;Prognosis
喉癌是耳鼻咽喉头颈外科三大恶性肿瘤之一，发病率较高，一直以来喉癌的模式以手术治疗为主，辅以术前术后放疗。中晚期喉癌患者手术治疗后，尤其全喉切除加颈部淋巴结清扫，生活质量明显下降，而化疗+(-)放疗可使患者保留患病喉组织，提高生活质量。在治疗的实际应用中，由于多药耐药的出现，致使化疗的效果并不尽人意。为探讨喉癌中耐药基因蛋白的表达与肿瘤的临床病理特征预后之间关系，我们选取72例喉癌患者用免疫组化方法进行研究。
1 资料与方法
11 一般资料
选取19961~20001月河北北方学院附属第一耳鼻咽喉头颈外科诊治的喉癌病人72例，每例均有完整的临床及病理资料、手术记录及5年以上的随访资料，所有病人术前均未行放射或化学治疗。其中男67例，女5例；年龄32~80岁，平均年龄5693岁；根据1997年UICC分期标准，Ⅰ期17例，Ⅱ期7例，Ⅲ期26例，Ⅳ期22例；72例中有淋巴结转移的29例，无转移的43例；病理类型及分级：高分化鳞癌28例，中分化鳞癌41例，低分化鳞癌3例；手术方式：其中行喉裂开术9例，喉垂直部分切除术8例，喉声门上水平部分切除术16例，喉3/4切除术3例，喉近全切除术6例，全喉切除术29例；经过5年的随访观察，23例死亡，5年生存率6805%。
12 试剂和方法
所有标本经10%甲醛固定，石蜡包埋，制成4μm的连续切片,TS、Pgp、GSTπ和TopoⅡ一抗试剂盒均购自北京中山试剂公司。免疫组化步骤：二甲苯脱蜡、梯度酒精至水,3％双氧水灭活内源性过氧化酶,PBS缓冲液振洗（采用专业微波炉进行抗原微波热修复），正常山羊血清封闭，一抗冰箱过夜，二抗、三抗各1h，DAB显色10~15min，复染核脱水透明，中性树胶封片。用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照,用已知阳性的结肠癌或肝癌组织作阳性对照。
结果判断标准：光学显微镜下以细胞膜、浆、核中存在粗细一致的棕黄色颗粒为阳性,其中Pgp阳性颗粒分布于胞浆和/或胞膜,GSTπ阳性颗粒分布于胞浆和/或胞核,TopoⅡ阳性颗粒分布于胞核，TS阳性颗粒分布于胞浆。根据染色的细胞数量及染色强度分为阴性(-):无阳性细胞染色;弱阳性(+):阳性细胞1%～25%;中度阳性(++):阳性细胞26%～50%;强阳性(+++):阳性细胞＞50%。
13 统计学处理
应用SPSS100统计软件进行处理，采用秩和检验分析其相关性。
2 试验结果
72例喉癌患者病例中，Pgp阳性66例、GSTπ阳性50例、TopoⅡ阳性28例和TS阳性12例。Pgp、GSTπ在无淋巴结转移患者中的阳性率明显低于有淋巴结转移者，TopoⅡ在无淋巴结转移患者中的阳性率明显高于有淋巴结转移者（见表1）。
Pgp、和GSTπ阳性表达的患者其程度有较大差别，其与临床病理特征及5年生存率的关系（见表2），显示临床分期越晚则GSTπ的表达强度越高；而Pgp阳性表达强度与各个相关指标均相关，即表达愈强则病理分型越差、临床分期越晚、淋巴转移越多、复发率越高、5年生存率越低。
临床病理特征、耐药基因蛋白表达与术后生存之间的关系（见表3），分析显示患者的病理分级、临床分期、术后是否复发及GSTπ的表达均与术后生存时间明显相关。即病理类型临床分期较重、出现局部复发和GSTπ的表达水平越高，患者的生存时间越短，5年生存率越低。表1 TS、Pgp、GSTπ和TopoⅡ阳性表达与临床资料的关系表3 临床病理特征、耐药基因蛋白表达与术后生存之间的关系
3 讨论
早期喉癌很少发生远处转移，所以喉癌的一直以来以手术和放疗为主，预后较好。各家报道稍有区别，季文越[1]等报告1115例喉癌患者的5年生存率，Ⅰ期为94%，Ⅱ期为89%，Ⅲ期为82%，Ⅳ期为66%。喉全切除术565例，5年生存率68%，喉部分切除术550例，5年生存率85%。术后生存率与临床分型分期、淋巴是否转移及手术方式有关。我们所选的72例患者中Ⅰ、Ⅱ期24例，5年生存率875%；Ⅲ、Ⅳ期48例，5年生存率583%。全喉切除29例，喉部分切除43例，5年生存率分别是517%和790%。统计分析喉癌患者的术后生存与其病例分级临床分期及术后是否复发有关，与国内外相关报道一致，而该组患者总体5年生存率685%，较其它报道低可能与其临床分型以声门上型为主，分期Ⅲ、Ⅳ期较多及手术方式选择有关。
肿瘤的多药耐药（MDR）是指肿瘤细胞对多种结构功能不同/杀伤机理迥异的化疗药物同时产生交叉耐药现象。其机制主要有以下几个方面：一是肿瘤细胞内多药耐药基因（MDR1）及其表达产物P糖蛋白（Pgp）介导的多药耐药现象，成为典型多药耐药；二是由拓扑异构酶介导的，称为非典型多药耐药；三是谷胱甘肽s转移酶的表达；四是胸苷酸合成酶的表达。
Pgp是MDR1细胞膜上一种分子量为16864u的膜糖蛋白,该蛋白跨膜结构具有能量依赖性“药泵”功能,发挥将细胞内药物主动转运至细胞外的作用,使细胞内药物蓄积减低药量减少，从而使细胞对该药产生耐药，同时对不同的亲脂类药物产生交叉耐药。已有研究表明，MDR1在宫颈癌、肾细胞癌、肝癌中通常高水平表达；蔡晓岚等[2]应用逆转录多聚酶链式反应技术，检测了35例喉癌患者MRPmRNA的表达，结果显示阳性率457%，其阳性表达强度在晚期肿瘤中明显增高，且与肿瘤颈淋巴结转移明显相关。我们的实验结果显示：喉癌患者Pgp阳性率916%，其表达阳性率与患者是否发生淋巴结转移呈相关性，有淋巴结转移阳性率明显高于无淋巴结转移者，统计显示有显著性差异。Pgp阳性表达与术后生存时间之间无明显相关性，不能作为判断喉癌预后的指标。其阳性表达强度在病理分级、临床分期、淋巴结转移与否、肿瘤是否复发及5年生存与否之间均有显著性差异。即病理分级越差、临床分期越晚、有淋巴结转移、5年内复发及转移、生存不足5年者表达程度越高。
GSTπ是一种多功能药物代谢酶,不仅可催化亲电物质与谷胱甘肽结合,而且本身可以与亲脂性细胞毒药物结合增加其水溶性,促进其代谢,从而降低抗癌药物的细胞毒作用而产生耐药。GSTπ主要分布于消化道、泌尿道、呼吸道上皮，其表达与结肠癌临床分期呈正相关。GSTπ阳性则对顺铂、氮芥、环磷酰胺、瘤可宁、阿霉素等药物疗效不佳。Arai等[3]报道GSTπ阳性表达对顺铂加足叶乙甙的化疗方案敏感,可作为化疗疗效的预测因素之一。Deffie等[4]认为GSTπ含量增加是阿霉素耐药因素之一。我们的试验显示：GSTπ阳性率694%，其表达强度与喉癌的淋巴结转移及5年生存率呈相关性，有淋巴结转移阳性率明显高于无淋巴结转移者，统计显示有显著性差异，生存时间大于5年者阳性率明显小于生存时间不足5年者。GSTπ表达阳性率与术后生存时间相关，生存时间越短则阳性率越高，因此认为GSTπ可以作为临床预后的指标。GSTπ阳性表达程度与临床分期及5年生存率相关，表达越强则临床分期越晚，5年生存率越小。
TopoⅡ是一种能催化DNA双链拓扑异构体相互变换的基本核酶[5]，在哺乳类动物体内，它有两种同工酶TopoⅡα和TopoⅡβ，它们是不同基因的产物。其中，TopoⅡα是许多TopoⅡ抑制剂如胺吖啶、蒽环类、鬼臼毒素及依托泊甙等的重要靶点，故细胞内TopoⅡα水平直接影响TopoⅡα抑制剂的抗肿瘤作用，TopoⅡα表达水平越高则对抗癌药物敏感性越高，而TopoⅡα数量减少或活性下降则导致TopoⅡα抑制剂细胞毒作用降低，从而引起多药耐药现象。我们的实验结果显示TopoⅡ阳性率为416%，其表达阳性率与患者是否发生淋巴结转移呈相关性，有淋巴结转移阳性率明显低于无淋巴结转移者，统计显示有显著性差异。而与其他临床病理指标无相关性，与术后5年生存率及生存时间亦无相关，不能作为喉癌预后的指标。
TS是胸甘酸合成的限速酶[6]，可使dUMP甲基化形成dTMP,dTMP为DNA合成基本原料dTTP的前体，其在DNA合成与修复中起重要作用。因此，TS成为肿瘤化疗中重要的靶向酶。多数研究结果表明，TS高表达患者的5年生存率和对含5FU化疗方案的效果要差于低表达者。Choi等[7]对103例胃癌标本TS表达进行检测，结果显示，TS高表达与肿瘤病理类型较差和临床分期较晚密切相关,提出TS高表达预示着肿瘤具有较强的侵袭性。本实验结果TS阳性率1667%，其表达与临床病理资料无明显相关。且与术后生存时间无相关性，不能作为喉癌预后的判断指标。
1 季文樾,杜强,关超,等.1115例喉癌患者的生存分析［J］.中华耳鼻咽喉科杂志,2004,39(1):1719
2 蔡晓岚,王天铎,范献良,等.喉癌患者多药耐药相关蛋白基因的表达及临床意义［J］.临床耳鼻咽喉科杂志,1999,13(1):2325
3 Arai T,Yasuda Y,Takaya T,et al.Immunohistochemical expression of glutathione transferasepi in untreated primary nonsmallcell lungcancer［J］.Cancer Detect Prev,2000,24(3):252257
4 Deffie AM,Alam T,Seneviratne C,et al.Multifactorial resistance to adriamycin:relationship of DNA repair,glutathione transferase activity,drug efflux,and Pglycoprotein in cloned cell lines of adriamycinsensitive and resistant P388 leukemia［J］.Cancer Res,1988,48(13):35953602
5 陆东东,夏正香.拓扑异构酶与肿瘤细胞耐药性[J].肿瘤临床与研究, 1994,6(2):127128
6 崔雅静,张健慧.胸苷酸合成酶基因多态性及其与肿瘤临床的关系［J］. 国外医学遗传分册,2004,27(6):349353
7 Choi JH,Lim HY,Nam DK,et al.Expression of thymidylate synthase in gastric cancer patients treated with 5fluorouracil and doxorubicinbased adjuvant chemotherapy after curative resection［J］.Br J Cancer,2001,84:186192
