金黄色葡萄球菌肠毒素的研究进展
【关键词】 葡萄球菌
葡萄球菌是革兰阳性球菌中的一种，广泛分布于界，如：空气、水、土壤等，同时存在于人体、动物体的皮肤及其与外界相通的腔道中。绝大部分不致病，少数可引起人类感染，其中的金黄色葡萄球菌致病力最强，主要是因为其产生大量的侵袭性物质，如：各种酶类，多种毒素和菌体的一些成分等等。金黄色葡萄球菌产生的主要酶类有：凝固酶、耐热核酸酶、葡激酶等；产生的主要毒素有：肠毒素、葡萄球菌溶素、杀白细胞素、表皮剥脱毒素、毒性休克综合征毒素—1等。目前国内外对金黄色葡萄球菌肠毒素的研究主要集中在检测方法和作为超抗原的致病性两个方面。
1 金黄色葡萄球菌肠毒素的临床意义
1.1 食物中毒 无论是过去还是现在，金黄色葡萄球菌肠毒素是个世界性卫生问题，在美国由其引起的食物中毒占整个细菌性食物中毒的33%，加拿大则更多为45%，我国发生此类事件也非常多，是卫生防疫部门重点检测项目。一般情况下是进食了被金黄色葡萄球菌污染的食物，属于毒素型食物中毒，产生的肠毒素（一般认为约1μg/kg）刺激呕吐中枢而导致以呕吐为主要症状的食物中毒。所以有关部门建议：储存食物，尤其是含蛋白质多水分多淀粉多的熟食，应在4℃，以防止微生物大量繁殖，继而产生大量的毒素，其中金黄色葡萄球菌肠毒素是主要毒素之一[7]。
1.2 肠道外感染 近年来的研究表明金黄色葡萄球菌的肠毒素不仅引起食物中毒，在由金黄色葡萄球菌引起的化脓性感染中也起重要的作用。姚咏明[9]等通过对烫伤脓毒血症大鼠急性肺损伤的研究，发现金黄色葡萄球菌肠毒素B型的单克隆抗体能够对烧伤合并葡萄球菌感染的肺损伤起到很明显的保护作用，同时金黄色葡萄球菌产生的肠毒素SEB能刺激淋巴细胞大量活化，促炎细胞因子产生显著增加，致使炎症细胞浸润，组织坏死，尤其是肺组织中的中性粒细胞聚集更加明显。而肾脏有储蓄和排泄肠毒素的功能，所以毒素对肾脏的损伤也较明显，以至产生对全身其他各器官组织的损伤作用，最后可以到多个器官功能障碍，危及人类生命。
1.3 与川崎病的关系 在最近几年的研究中发现金黄色葡萄球菌肠毒素还与川崎病的临床病理密切相关[2]。此病好发年龄在3个月～6年之间，主要病理变化是全身性多发性动脉炎，尤以冠状动脉的损害直接危及患者的生命，给家庭和年轻的父母造成很大心理伤害。虽然川崎病的病因目前还不是十分清楚，但是有研究认为其发病与免疫系统激活有密切关系：由于巨噬细胞、T细胞活化以及细胞因子释放等，导致了以心血管损伤为中心多种抗原刺激后的变态反应，在这一过程中，内皮细胞的游走与血管壁的损伤是诱发本病的最重要因素，它最终能导致冠状动脉瘤以及内腔狭窄。而金黄色葡萄球菌普遍存在于人体各部位，由于幼儿对其免疫性弱，作为条件致病菌合并感染在临床上是常见的，感染后金黄色葡萄球菌产生的肠毒素作为超抗原能够激活大量淋巴细胞，既而产生大量的细胞因子，参与β细胞多克隆活化，使免疫球蛋白合成增加，产生自身抗体，同时可诱导粘附分子在血管内皮细胞上的表达，导致内皮细胞的损伤及游走，这些因素是启动川崎病动脉炎发生的重要原因。
1.4 超抗原作用[1] 作为一种超抗原，金黄色葡萄球菌肠毒素能够以MHC非限制性及TCRνβ特异性的方式激活大量（为普通抗原的数千倍）T细胞并使其增殖，由此引发的肠毒素作为超抗原恶性肿瘤也在积极的研究。这种具有生物活性的肠毒素通过活化大量的具强大杀伤力T淋巴细胞（CD4+和CD8+），使其增加释放细胞因子（IL-1,IL-2,TNFα和INF-γ等），通过特异的抗原决定簇与肿瘤细胞结合并使其凋亡。这项研究正处在动物实验阶段，如果将来能够在人类实施则是医学界的一大飞跃。
2 金黄色葡萄球菌肠毒素的生物学性状
2.1 性质[8] 金黄色葡萄球菌肠毒素是一组对热稳定的可溶性蛋白质（易溶于水和盐溶液），耐热100℃30min，分子量为26～30kDa,能够抵抗胃肠液中蛋白酶的水解作用。
2.2 分型[8] 金黄色葡萄球菌产生多种肠毒素，均能引起人类急性胃肠炎，根据其抗原性和等电点的不同，分为A，B，C1，C2，C3，D，E，G和H9个血清型（多以SEA—SEH表示），以A，D型多见。编码这9种肠毒素的基因大多位于染色体上（SED是由质粒编码的），细菌质粒上可能含有激活肠毒素的蛋白质基因。国外报道[3]：新近发现一种金黄色葡萄球菌肠毒素，是由两个质粒编码，在大肠埃希菌中能够表达，核甘酸序列显示接近SEG血清型，功能上也能够大量激活T淋巴细胞的一种新肠毒素，命名为SER。
2.3 关系 致病性金黄色葡萄球菌能够产生血浆凝固酶，肠毒素和耐热核酸酶，三者之间存在密切关系，尤其是耐热核酸酶过去在临床上可以粗劣的平行判断肠毒素的产生。目前针对金黄色葡萄球菌研究的热门话题是金黄色葡萄球菌的耐药性，也与肠毒素的产生有关联：耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）近100%产生肠毒素；而甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）约有30%产生肠毒素。
3 检测方法
3.1 动物学试验[8] 经典的方法是采用幼猫腹腔注射（肉汤培养物或呕吐物），4h内发生呕吐腹泻和体温升高或死亡等现象者，提示金黄色葡萄球菌肠毒素存在。
3.2 免疫血清学试验 金黄色葡萄球菌肠毒素作为抗原与试剂中的标记抗体结合，经标记物显色或发光，以检测样本中的肠毒素。常用ELISA方法和EIA检测，其优点是方法简便，不需特殊仪器，不用特殊手段提取抗原，但目前只有国外几个公司的试剂能够分型，且价格昂贵，不适合大批量检测的需要。姚咏明[9]等采用改良双单抗夹心酶联免疫吸附试验(BA-ELISA)方法检测动物血浆及组织匀浆中SEB，利用单克隆抗体的特异性和生物素-链亲素系统的放大原理，使该方法的检测灵敏度显著升高，可达0.078μg/L，检测范围为0.078～20.0μg/L，血浆中SEB的回收率为88.7%～106.2%。吴斌[10]等尝试用反向被动乳胶凝集试验（RPLA）和免疫荧光法（ELFA）结合进行检测,试验所需时间太长（20h），不适用于临床检测。另据国外报道[5]：一种改良的ELISA方法——快速免疫色析手工操作法（rapid immunochromatographic?based hand?hold assay.）能够在15min之内检测出500pg/ml的肠毒素。
3.3 聚合酶链反应技术 国内管俊昌[6]等报道应用金黄色葡萄球菌肠毒素中的B型引物①5’TCGCATCAAACTGACAAACG3’②5’GCAGGTACTCTATAAGTGCC3’，94℃变性2min，55℃退火2min，72℃延伸1min，循环30次，最后一个循环72℃，延伸5min，琼脂糖凝胶电泳观察478bp的条带。这种方法特异，敏感，又能够分型，但其费用高，操作要求严格，易出现污染而得到假阳性。
3.4 生物分子介导的光谱分析法BIA/MS[4] 其原理是利用表面等离子体谐振技术（SPR）的免疫吸附反应，捕获SEB之后再解吸附和激光离子化进行光谱分析，此方法国外报道最低检出线为ng水平，这是一种既定量又定性的好方法。国内有向四海等利用SPR—2000生化分析仪和金黄色葡萄球菌肠毒素羊的单克隆抗体检测到最低浓度为1μg/ml水平。
3.5 根据耐热核酸酶和肠毒素具有的平行关系，我们也可以进行检测。常规方法检测耐热核酸酶也较繁琐，不适合快速检测的要求。最近3M公司提供的Petrifilm.RSA.测试薄膜是由二部分组成。第一部分是由黄金色葡萄球菌培养基片，此培养基中含有经修正的Barid?Parker，营养成分加上以冷水可溶解的胶质。第二部分是一种耐热核酸酶（TNase）反应片，含有DNA、甲苯胺兰及指示剂，此指示剂有助于菌落的计数及确定葡萄球菌耐热核酸酶的存在。在Petrifilm.RSA检测片上，耐热DNA酶反应看起来，呈粉红色环带包围着一个红色或兰色的菌落，这不失为一种很好的方法，可以在培养的同时检测出耐热核酸酶，即：筛选出产肠毒素株，之后有必要再进行分型。这种方法对于卫生检测和临床检验都很适用。
综上所述，摆在我们面前的任务是：一、要广泛深入细致的研究金黄色葡萄球菌肠毒素的致病机理，包括毒素型疾病和超抗原型疾病。二、要进行快速适用的检测。金黄色葡萄球菌分布广泛，致病力又强，同时也是院内感染最为常见的细菌，耐药菌株和变异菌株不断出现，给卫生防疫工作和临床检验带来巨大挑战。但随着的进步，各种检测方法日新月异，相信通过不懈的努力和意识的提高，作为超抗原的抗肿瘤研究都将取得丰硕的成果。
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1 Sjoberg A, Wallen?Ohman M, Antonsson P,et al. Identification of the antigenic epitopes in staphylococcal enterotoxins A and E and design of a superantigen for human cancer therapy /[J/] Mol Biol,2003,333(5):893?905
2 Nomura Y, Masuda K, Yoshinaga M. Possible relationship between streptococcal pyrogenic exotoxin A and Kawasaki syndrome in patients older than six months of age /[J/] Pediatr Infect Dis，2003,22(9):794?8
3 Omoe K, Hu DL, Takahashi?Omoe H, Nakane A,etal. Identification and characterization of a new staphylococcal enterotoxin?related putative toxin encoded by two kinds of plasmids /[J/] Infect Immun，2003,71(10):6088?94
4 Nedelkov D, Nelson RW. Detection of Staphylococcal enterotoxin B via biomolecular interaction analysis mass spectrometry /[J/].Appl Environ Microbiol，2003,69(9):5212?5
5 Schotte U, Langfeldt N, Peruski AH. Detection of staphylococcal enterotoxin B (SEB) by enzyme?linked immunosorbent assay and by a rapid hand?held assay /[J/]. Clin Lab, 2002,48(7?8):395?400
6 管俊昌, 夏佩莹.金黄色葡萄球菌L型产B型肠毒素及其基因的研究 /[J/].蚌埠医学院学报，2004，29（4）：283?285
7 李毅.金黄色葡萄球菌及其肠毒素研究进展 /[J/].卫生检验杂志,2004,14(1):392?395
8 周正任. 医学微生物学［M］.第六版.北京：人民卫生出版社，2004,135?142
9 李红云, 姚咏明.金黄色葡萄球菌肠毒素B单克隆抗体对烫伤脓毒症大鼠急性肺损伤的影响 /[J/].中国实验外科杂志,2001,17（3）:228?229
10 吴斌，秦成，裴秩君，等.食品中金黄色葡萄球菌肠毒素的快速检测方法 /[J/].微生物学通报,2004,31(5):93?95
