人胰腺癌细胞CFPAC?1裸小鼠原位移植瘤模型的建立

【摘要】  目的：建立人胰腺癌裸小鼠原位移植瘤模型，并对其生物学特性进行研究。方法：将人胰腺癌细胞CFPAC?1接种于裸鼠皮下，并将皮下肿瘤组织原位移植于裸鼠胰腺，比较两种移植瘤的生长及转移情况。结果：胰腺癌皮下移植瘤模型与胰腺癌原位移植瘤模型的体内成瘤率、生长情况及形态学上均无显著差异。皮下移植瘤模型呈局限性生长，无一例发生远处转移；原位移植瘤模型远处转移率高达87.5％，发生75.0％腹膜转移，37.5％肝转移，12.5％肺转移，37.5％淋巴结转移，并保持分泌CA19?9的特性。结论：人胰腺癌裸小鼠原位种植瘤模型明显优于皮下移植瘤模型，较好地模拟了人胰腺癌生长和局部浸润及远处转移过程，是胰腺癌体内研究理想的动物模型。

【关键词】  胰腺癌 裸小鼠 动物模型

    胰腺癌是一种恶性程度极高的肿瘤之一，在西方国家其死亡率列癌症死亡第4位。在我国胰腺癌的发病率也呈上升趋势，20年约增长6倍[1]，每年发病人数已达7.5万人，5年生存率＜5％。手术切除是胰腺癌能够达到根治的唯一选择，但大部分患者由于在确诊时已发生广泛转移而失去手术的时机，同时胰腺癌对放疗、化疗不敏感，因此建立适宜的人胰腺癌动物模型，可以为深入研究胰腺癌的发生、侵袭转移机制以及寻找新的策略提供有效的手段。

    1  材料与方法

    1．1  材料

    1．1．1  细胞与细胞培养  人胰腺癌细胞株CFPAC?1购自院上海细胞生物研究所，用含10％热灭活的小牛血清（Gibco公司）、100 U·ml-1青霉素和100 μg·ml-1链霉素的高糖DMEM（Gibco公司）培养基作为CFPAC?1细胞培养液，于5％CO2、饱和湿度、37℃的细胞培养箱内常规培养。

    1．1．2  实验动物  BALB/C nu/nu裸小鼠，雌雄各半，4～6周龄，体质量18～20 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，动物许可证号SCXK(沪)2007?0005，在我校实验动物中心SPF级动物房中分笼饲养，饲料、饮水、笼具和操作器材及其它用品均灭菌处理后使用，实验时按无菌原则操作。

    1．2  方法

    1．2．1  皮下移植瘤模型  人胰腺癌细胞株CFPAC?1体外常规传代培养，0.125%胰酶消化处于对数生长期细胞，冰冷的无菌磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次，最后用PBS重悬成浓度为107ml-1的单细胞悬液。75％酒精棉球消毒裸小鼠皮肤，将(2～3)×106（0.2 ml）的单细胞悬液接种于裸鼠右肩背部皮下,建立皮下移植瘤模型。密切观察皮下肿瘤生长情况，每周用游标卡尺测量肿瘤大小，按公式V＝1/2长径×短径2，肿瘤体积，并绘制皮下移植瘤生长曲线。

    1．2．2  原位移植瘤模型  3周左右待皮下移植瘤长至1 cm大小时，颈椎脱位法处死皮下荷瘤鼠，消毒皮肤，取下肿瘤，浸入含100 U·ml-1青霉素和100 μg·ml-1链霉素的高糖DMEM无血清培养基，去除中央坏死组织，选取周围健康肿瘤组织，剪成大小约1 mm3瘤块供原位移植用。1％戊巴比妥钠溶液（50 mg·kg-1）腹腔注射麻醉裸鼠，75％酒精消毒皮肤，左上腹直肠旁线处行1 cm的纵行切口，仔细分开胃与脾之间的薄膜，暴露胰腺，剪开胰腺被膜，将1 mm3瘤块植入胰体尾处（图1），以8?0可吸收外科缝线缝合胰腺被膜。将胰腺轻轻送回腹腔，6?0可吸收外科缝线单层缝合腹壁肌层及皮肤。以上所有操作均在超净台内进行，术者佩戴外科手术放大镜。裸鼠均于术后第8周处死，收集标本待检。

    左↑示胰腺，右↑示脾脏图1  外科手术原位移植

    Fig 1Surgical orthotopic implantation.The left arrow shows pancreas,the right on shows spleen.

    1．2．3  检测指标  以上两组处死的裸鼠均经详细的解剖学检查，测量肿瘤体积，观察周围脏器侵袭及远处转移情况。收集肿瘤原发灶，以及所有可能发生侵袭、转移的脏器，如肝、肾、脾、肺、腹膜、淋巴结等标本，用10％中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，以4 μm厚度连续切片，行HE染色，常规光镜检查确定转移灶。部分标本行CEA免疫组化染色。处死时心脏采血，收集血液，送至我院检验科检测肿瘤相关抗原CA19?9和CEA。

    1．3  统计学处理

    计量资料和计数资料分别采用t检验和χ2检验进行统计学分析,P<0.05表示差异有统计学意义。

    2  结果

    2．1  移植瘤生长状况

    皮下接种经3～4 d潜伏期，接种部位皮下可见灰白色结节，后呈圆形或椭圆形生长，每周测量肿瘤长径和短径，计算肿瘤体积，并绘制生长曲线(图2)。人胰腺癌细胞裸鼠皮下移植瘤的成瘤率为100％(6/6)，且随时间的增加而增大,无自发消退现象。5周左右时皮下肿瘤长至2.154 cm×1.375 cm大小，接种部位皮肤出现破溃、结痂，8周处死时荷瘤鼠明显消瘦，呈恶病质状态。8只裸鼠接受原位移植，成瘤率为100％（8/8），无一只裸鼠在移植时和移植后发生与手术相关的并发症。原位移植6周后，可见裸鼠上腹部明显膨隆，可触及明显的质硬包块，至8周处死时裸鼠呈明显消瘦、纳差。

    图2皮下移植瘤生长曲线

    Fig 2  The growth curve of the subcutaneous implanted tumor model

    2．2  血清学检测

    用电化学发光免疫法(ECLIA)检测所有原位移植瘤裸鼠血液标本的CA19?9和CEA的表达水平。正常裸鼠CA19?9和CEA的浓度均值分别为20 U·ml-1和3.0 ng·ml-1。所有原位移植瘤裸鼠CA19?9的浓度均高于1 000 U·ml-1，最高达2 544 U·ml-1，其中有2只裸鼠CEA浓度高于值范围。

    2．3  病检查

    皮下肿瘤质地较硬，圆形或椭圆形，表面可见滋养血管生成，切面灰白色呈鱼肉状，中心部分肿瘤组织液化坏死，肿瘤包膜完整与周围组织分界清楚，较易剥离。处死时经详细的解剖学及光镜检查无一例发生远处转移。移植瘤镜下见:肿瘤细胞形态不一，多呈多角形，细胞核增大，核浆比例增加。核大小、形态、染色不一，可见巨核、双核、多核，甚至奇异形核，核仁大而多，病理性核分裂像多见，其内可见较丰富的血管，与原位移植瘤及转移灶的病理形态基本一致（图3、4）。原位移植瘤呈圆形或椭圆形,表面凹凸不平，无完整包膜形成，呈浸润性生长与周围组织分界不清，并发生远处转移（图5）。转移率高达87.5％（7/8），75.0％（6/8）发生腹膜转移，37.5％（3/8）肝转移，12.5％（1/8）肺转移，37.5％（3/8）淋巴结转移。皮下移植瘤与原位移植瘤生物学特性比较见表1。表1  两种胰腺癌移植瘤模型生物学注：括号内为所占百分数图3  原位移植瘤组织病理（HE×200）

    3  讨    论

    胰腺癌发病隐匿，复发和转移是造成失败的主要原因。为了研究胰腺癌的转移机制，建立接近于人体的胰腺癌动物模型显得尤为重要。早期建立的人胰腺癌皮下移植瘤模型,虽能维持来源肿瘤的组织结构和生化特性,但由于皮下移植瘤易形成纤维性假胞膜，肿瘤呈局限性、膨胀式生长，很少发生远处脏器的转移[2?3]，不符合人胰腺癌的生物学特性，从而影响了它在研究人类肿瘤转移特性方面的价值。进一步研究表明,人癌在宿主体内表达侵袭转移能力,不但需要具备合适的移植环境,而且还依赖于瘤细胞之间、瘤细胞与宿主之间的相互作用[4]。近年来，根据原位移植理论建立起来的人胰腺癌原位移植瘤模型克服了这一缺陷，它不仅维持了原有瘤组织的结构，而且还保持了人体肿瘤的绝大部分生物学特性，特别是转移特性，它在宿主体内能以类似于患者体内的方式显示其恶性行为包括了原发肿瘤的生长、局部的浸润和随后远处脏器的转移整个过程[5?7]。

    目前已通过人胰腺癌细胞悬液注射法和胰腺癌病人手术标本移植法成功建立人胰腺癌原位移植瘤模型[5，8]。Hotz等[5]将人胰腺癌细胞悬液注射至裸鼠胰腺,细胞悬液注射法与组织块移植法相比具有成瘤率低，注射时细胞容易脱落人为造成腹腔及切口处广泛种植等缺点。本实验采用Katzl等[6]法成功地建立了人胰腺癌裸小鼠原位移植瘤模型。该模型显示较强的浸润和转移特性，较皮下移植瘤更接近人胰腺癌的临床表现，并且所有裸鼠外周血能检测到CA19?9的表达，提示外周血CA19?9检测阳性可作为人胰腺癌裸小鼠原位移植成功的重要标志。

    本试验成功地建立了人胰腺癌细胞CFPAC?1裸鼠原位移植瘤模型,不仅成瘤时间短,成瘤率高,肿瘤组织病理和生物学特性比较稳定,而且还能模拟人胰腺癌生长和局部浸润及远处转移过程,有利于对干预效果进行全面观察,这肯定有助于人们更深入地研究胰腺癌发病机制、寻求新的治疗手段以及筛选新型抗肿瘤药物。

【参考】
  [1]李连弟.胰腺癌死亡情况报告[J].中华流行病学杂志,2003，24(6)：520?522.

[2]SORDAT B C，UEYAMA Y，FOGH J.Metastasis of tumor xenografts in the nude mouse[M]//FOGH J，GIOVANELLA B C.The nude mouse in experimental and clinical research.New York:Academic Press,1982:95?143.

[3]FIDLER I J.Critical factors in the biology of human cancer metastasis[J].Am Surg,1995,61:1065?1066.

[4]FU X，HOFFMAN R M.Human ovarioan carcinoma metastatic models constructed in nude mice by orthotopic transplantation of histologically?intact patient specimens[J].Anticancer Res,1993,13(2):283?286.

[5]HOTZ H，REBER H，HOTZ B，et al.An orthotopic nude mouse model for evaluating pathophysiology and therapy of pancreatic cancer[J].Pancreas,2004,26(4):e89?e98.

[6]KATZL M H，TAKIMOTO S，SPIVACK D,et al.An imageable highly metastatic orthotopic red fluorescent protein model of pancreatic cancer[J].Clin Exp Metastasis,2004,21:7?12

[7]BOUVET M,SPERNYAK J，KATZ M H,et al.High correlation of whole?body red fluorescent protein imaging and magnetic resonance imaging on an orthotopic model of pancreatic cancer[J].Cancer Res,2005，65(21):9829?9833.

[8]FU X,GUANDAGNI F,HOFFMAN R M,et al,A metastatic nude?mouse model of human pancreatic cancer constructed orthotopically with histologically intact patient specimens[J].Proc Natl Acad Sci,1992,89:5645?5649.