基因相关肽的制备及其应用的初步研究
【关键词】 人甲状旁腺素 滴鼻剂 骨质疏松症 骨密度 骨小梁
骨质疏松症是一种老年人和绝经后妇女的常见疾病，容易造成骨折，降低生活自理能力。甲状旁腺素（PTH）是一种由甲状旁腺分泌的激素，由84个氨基酸组成，是血钙的主要调节剂之一[1]。PTH小剂量多次给药具有明显的成骨作用，PTH（1?34）则完全保留了这种活性，所以PTH（1?34）成为目前治疗骨质疏松的理想药物[1?2]。PTH及其相关肽类药物都采用注射给药，频繁给药给患者带来极大的不便和痛苦。与注射剂相比滴鼻剂具有使用方便、患者依从性较好等特点，因此开发PTH（1?34）的滴鼻剂具有广阔的市场前景。
多肽类药物滴鼻给药，透过鼻黏膜吸收比较困难，而且易被吸收过程中的蛋白酶所降解[3]，除了从药剂学上来解决此问题，我们认为有必要对hPTH（1?34）进行结构改造。结构改造有两个目的，一方面为了增强其对蛋白酶的稳定性，避免吸收过程中酶的降解，另一方面增强其活性，弥补多肽类药物生物利用度较低的不足。经过查阅，我们选定将hPTH（1?34）改造为Pro?Pro?[Arg11]hPTH(1?34)?Pro?Pro，采用基因工程的方法来获得该肽，并制成滴鼻剂治疗卵巢摘除大鼠的骨质疏松症验证其药效。
1 材料与方法
1.1 材料
pET28ansB?C为本实验室构建保存，pET?28a购自TaKaRa公司，大肠杆菌BL21（DE3）为本实验室保存，CM52购自Whatman公司，二甲基?β?环糊精（DM?β?CD）购自Sigma公司，SD大鼠由药科大学动物实验中心提供，其他试剂均为进口分装或国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 Pro?Pro?[Arg11]hPTH(1?34)?Pro?Pro表达和纯化 通过PCR方法我们合成编码Pro?Pro?[Arg11]hPTH(1?34)?Pro?Pro的DNA片断，并将其插入质粒pET28ansB?C的BamH Ⅰ和 Hind Ⅲ两个酶切位点之间得到表达质粒pED?4PhPTH(1?34)。在该表达质粒中，Pro?Pro?[Arg11]hPTH(1?34)?Pro?Pro是通过酸敏感位点Asp?Pro连接到大肠杆菌门冬酰胺酶Ⅱ的C端127肽基因片段后。将该质粒测序验证后，转化E.coli BL21(DE3)LysE后进行表达，然后经包涵体洗涤，8 mol·L-1尿素溶解，乙醇分级沉淀获得融合蛋白，再经酸水解，CM?52柱层析获得目的多肽。
1.2.2 Pro?Pro?[Arg11]hPTH(1?34)?Pro?Pro的HPLC分析 反相柱为Shim?pack CLC?ODS 6.0 mm ID×15 cm，A相为0.1%的三氟乙酸水溶液，B相为纯乙腈，梯度为B相从20%到70%，洗脱时间为20 min，流速为1 ml·min-1，检测波长为280 nm，进样量为20 μl，温度为室温。
1.2.3 Pro?Pro?[Arg11]hPTH(1?34)?Pro?Pro滴鼻剂的制备及对卵巢摘除大鼠骨质疏松症的治疗 将不同质量浓度的Pro?Pro?[Arg11]hPTH(1?34)?Pro?Pro（2.500、1.250和0.625 mg·ml-1）、DM?β?CD(40 mg·ml-1)、聚丙烯酸（2.5 mg·ml-1）及EDTA?Na（0.1 mg·ml-1）溶解到生理盐水中，调pH 6.0，配制成高、中、低3个浓度的滴鼻剂。
将48只200 g左右的大鼠按体质量分为正常对照（Normal）组，假手术（Sham）组，生理盐水（NS）组，和高、中、低剂量（HhPTH，MhPTH，LhPTH）组，每组8只。对除正常对照组外其余大鼠进行卵巢摘除手术。饲养2周后，高、中、低剂量组每日滴鼻相应浓度滴鼻剂80 μl，生理盐水组每日滴鼻生理盐水80 μl。
1.2.4 骨密度和骨小梁厚度的测定 连续给药12周后，用美国Lunar公司产的双能X线吸收测量仪测定股骨和椎骨的骨密度（BMD）。处死动物，取一侧股骨头，置于4％戊二醛溶液中固定两周，用牙科金刚石锯将股骨头矢面锯开，取其中1片，经清洗，10％次氯酸溶液中浸泡6 h，超声清洗15 min，乙醇梯度脱水，乙醚浸泡，空气干燥，IB?3型离子溅射仪镀金，在日本产明石SX?40型电镜下观察，加速压为20 kV。300倍电镜观察，测量10处骨小梁直径，平均后得出骨小梁的直径，进行统计学处理。
1.2.5 对大鼠鼻黏膜的影响 取鼻黏膜，10％甲醛固定，常规取材，石蜡包埋，制片（4 μm厚），HE染色，光镜观察。
2 结 果
2.1 Pro?Pro?[Arg11]hPTH(1?34)?Pro?Pro的纯化
纯化得到的Pro?Pro?[Arg11]hPTH(1?34)?Pro?Pro经SDS?PAGE和HPLC分析纯度均达到95％以上（图1、2），经MS法测得其相对分子质量为4 549.79，与Pro?Pro?[Arg11]hPTH(1?34)?Pro?Pro的理论相对分子质量一致（图3），证明所得蛋白为目的蛋白。
2.2 Pro?Pro?[Arg11]hPTH(1?34)?Pro?Pro滴鼻剂对卵巢摘除大鼠BMD的影响
结果见表1。表1 各组大鼠椎骨骨密度测定结果与Sham组比较，1）P<0.05，2）P<0.01；与NS组比较， 3)P<0.001，4）P<0.01由表1可以看出，假手术组与正常对照组的大鼠腰椎骨骨密度无显著性差异(P>0.05)，而生理盐水组与正常对照组有显著性差异（P<0.05），说明造模成功；高、中剂量滴鼻给药组与生理盐水相比，大鼠腰椎骨骨密度有极显著性增加(P<0.001)，分别增高47.2％和35.3％，甚至高于假手术组(P<0.01)；低剂量滴鼻给药组与生理盐水组相比腰椎骨骨密度增高28.0％，差异非常显著（P<0.01），与假手术组无明显差异(P>0.05)。
2.3 Pro?Pro?[Arg11]hPTH(1?34)?Pro?Pro滴鼻剂对卵巢摘除大鼠股骨头骨小梁的影响
假手术组与正常对照组的大鼠股骨头骨小梁厚度无显著性差异，而生理盐水组与正常对照组有显著性差异，亦说明造模成功；高、中、低剂量滴鼻给药组与生理盐水相比，大鼠股骨头骨小梁厚度有极显著性增加(P<0.001)，增加43.9％～52.8％，甚至超过假手术组(P<0.05)，增加12.9％～19.9％，见表2。表2 各组大鼠股骨头骨小梁厚度
3 讨 论
多肽类药物滴鼻给药生物利用度不高，一是因为多肽类药物透过鼻黏膜比较困难，二是由于鼻腔内多种蛋白水解酶对多肽有降解作用。为了避免蛋白水解酶的水解，我们在PTH（1?34）的C端和N端都连接上Pro?Pro来保护，避免其受到蛋白酶的水解。
据文献报道，对PTH(1?14)中氨基酸进行一些取代,如Ser3→Ala、Asn10→Ala、Leu11→Arg、Gly→Ala、His14→Trp，能使其刺激cAMP生成的活性增加2～10倍[4]。我们用Arg取代hPTH（1?34）中Leu11以期获得更高的活性，弥补吸收过程中的损失。
如果C末端的残基为Arg、Pro或Lys，羧肽酶A将不起作用，如果C端第二位的残基为Pro，则羧肽酶A、B都不起作用，羧肽酶A、B水解作用受到其特异性的限制；肽酰脯氨酸氨基水解酶虽然能水解C末端第二位为Pro的多肽的C末端氨基酸，但是对于C末端为Pro而第二位不是Pro的多肽则不能水解，故其只能水解双Pro中的一个Pro[5?6]，所以，C端连上Pro?Pro能保护肽C端以免受到一些水解酶的水解作用。根据PTH与PTH/PTHrP受体结合模型，在PTH（1?34）的C端连接上Pro?Pro不会影响其与受体的结合，因此，C末端加上Pro?Pro之后，既不影响其活性，又能增强它对一些作用于C末端的水解酶的抵抗作用。
由PTH（1?34）与PTH/PTHrP受体相互作用的分子模建结果可知，N端的Ser1是PTH（1?34）与受体结合的两个接触点之一，它必须以游离氨基酸的形式存在，N端氨基酸的生物素化或者延伸都会显著减弱其活性[7]，如fMet?hPTH（1?84）经骨肉瘤生物检定其活性只有hPTH（1?84）的10％[8]；在hPTH的N端连接上Tyr或者Tyr?Gly?Gly能使其活性显著降低；在hPTH的N末端连上Met?Gly甚至导致其刺激AC的生物活性丧失[9]。但是通过体内活性检测我们发现，Pro?Pro?[Arg11]hPTH(1?34)?Pro?Pro对治疗OVX大鼠的骨质疏松有效。
二肽酶Ⅳ(DPP Ⅳ)是一种哺乳动物体内大量表达的氨基肽酶，能从肽的N末端释放二肽，它的最适底物为N末端是X?Pro?的寡肽，其次为N末端是X?Ala?的寡肽[10]。Gram等研究发现Pro?Pro?hPTH(1?38)的N端Pro?Pro?残基在体外能被二肽酶Ⅳ切割，DPP Ⅳ和Pro?Pro?hPTH(1?38)的摩尔浓度比为1∶106 655，反应约需24 h[11]。正常人体内的DPP Ⅳ血浆浓度约为(16.5±2.9)nmol·L-1[12]。文献报道治疗骨质疏松hPTH（1?34）用药量只需每天50～100 μg[13]，假设我们认为hPTH（1?34）与其相关肽用药量一样，并在血中均匀分布，而正常人的平均血容量为6.25 L，则给药后血中hPTH（1?34）相关肽的浓度为1.9～3.9 nmol·L-1，则给药后血中DPP Ⅳ与hPTH（1?34）相关肽的摩尔浓度比为8.5～4.2∶1。此外除了血浆中存在可溶性DPP Ⅳ外，体内还有丰富的DPP Ⅳ存在细胞膜上，他们在各种活化的炎症细胞以及上皮细胞上高度表达[14?15]。又有文献报道，GLP?1中的N末端的X?Ala?可被DPP Ⅳ和PPCE（post?proline cleaving enzyme）切割，GLP?1的体内半衰期少于2 min[16?17]。而DPP Ⅳ外切X?Ala?键的速度仅为外切X?Pro?速度的1％～5％，PPCE内切X?Ala?键的速度仅为内切X?Pro?速度的0.1％～1％[18]，因此Pro?Pro?[Arg11]hPTH(1?34)?Pro?Pro的N末端的X?Pro?应在2 min内被体内的DPP Ⅳ和PPCE切割掉[19]。我们可以推断出Pro?Pro?[Arg11]hPTH(1?34)?Pro?Pro吸收进入体内后，DPP Ⅳ和PPCE能迅速将其N端Pro?Pro?切割，使[Arg11]hPTH(1?34)?Pro?Pro的Ser1暴露出来，在与受体结合过程中发挥作用，产生活性。
DM?β?CD是一种毒性较小的鼻黏膜吸收促进剂，报道4％的浓度作为滴鼻剂吸收促进剂毒性最小，其促进吸收的效果也较为理想，因此我们采用4％DM?β?CD作为吸收促进剂[20?21]。为了增加Pro?Pro?[Arg11]hPTH(1?34)?Pro?Pro在鼻腔的滞留时间，延长药物与鼻黏膜的接触时间，我们加入聚丙烯酸增加滴鼻剂黏滞性[22]，最后加入EDTA作为防腐剂。由鼻黏膜的组织切片可以看出，该处方对鼻黏膜无损伤。本研究只是初步探索，所以关于滴鼻剂的剂型处方未进行优化设计，因此还有待进一步的研究。
卵巢摘除大鼠是一种公认的评价骨质疏松症药物的常见模型，它与妇女绝经后的骨质疏松症发病过程相似[1]。Pro?Pro?[Arg11]hPTH(1?34)?Pro?Pro制成滴鼻剂后治疗卵巢摘除大鼠的骨质疏松症效果非常明显，说明这种新型的多肽具有治疗骨质疏松症的前景。相比同类多肽，它的特殊结构使其非注射途径给药特别是鼻腔给药具有一定的优势，但还需要进一步与其他同类多肽进行比较来验证。
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