血管端端吻合法建立双侧供肾大鼠肾移植模型

【摘要】  目的：采用血管端端吻合法建立一种无需阻断主动脉和后腔静脉血流的双侧供肾大鼠肾移植模型。方法：取供体双侧肾脏，受体左侧肾窝单肾移植，生理盐水中血管端端吻合，输尿管膀胱瓣膀胱外隧道式吻合行尿路重建。结果：40例移植肾肾动、静脉即时通畅率分别为85%（34/40）、90%（36/40），吻合血管无扭曲。模型并发症有吻合口出血、动静脉血栓形成、排斥反应等，不使用免疫抑制剂的情况下，90%受体存活时间超过7 d。结论：生理盐水中行血管端端吻合，可解决动脉吻合需阻断主动脉血流、静脉吻合需支架支撑、静脉粘贴缝合困难等问题，是一种简单、、省时的模型方法，一般实验室均可开展。

【关键词】  静脉 吻合 肾移植 动物模型 大鼠

    大鼠肾移植模型是研究移植免疫排斥反应及各种药物对移植肾影响的重要动物模型。Pahlavan等[1]认为对于大鼠肾移植模型，肾动脉端端吻合是金标准，最为推荐肾静脉端端吻合。目前，国内尚无不阻断腹主动脉和后腔静脉血流的血管端端吻合双侧供肾大鼠肾移植模型的相关报道。我们参阅相关，成功建立了无需阻断腹主动脉、后腔静脉血流，无需支架支撑血管壁的一种血管端端吻合双侧供肾大鼠肾移植模型，为移植排斥反应、移植免疫耐受等研究提供了一个简便、经济、省时的方法。

    1  材料和方法

    1.1  材料

    1.1.1  实验动物  受体、供体均为清洁级健康雄性SD大鼠，购自院上海动物研究所，平均体质量（275±25）g。

    1.1.2  手术器械  HC?X803显微外科手术器械（宁波市成和显微器械厂），9?0医用无损伤缝合线，显微外科血管夹，SXP?1双人双目外科手术显微镜（上海医用光学仪器厂），0.9×30静脉套管留置针，无菌冰盒，冲洗针，婴儿腹壁撑开器等。

    1.1.3  药品  1%氯胺酮溶液、125 U·ml-1肝素钠生理盐水溶液、含肝素钠林格液（4℃）、青霉素钠针剂、碘伏、0.25%利多卡因+0.2%罂粟碱生理盐水溶液。

    1.2  方法

    1.2.1  麻醉及术前处理  供体术前无需禁食、禁水，受体术前12 h禁食不禁水，供、受体均以1%氯胺酮溶液按1 ml·（100 g）-1腹腔注射麻醉。

    1.2.2  供体手术  麻醉成功后固定，碘伏常规消毒，腹正中十字切口，4线牵拉固定。湿盐水纱布包裹胃、肠、脾置右侧腹腔外。采用水分离法[2]游离左肾及其动、静脉，游离腹主动脉和后腔静脉，前至主动脉裂孔和肝脏，后至腹主动脉分叉前方，除去血管周围脂肪和结缔组织；同法分离出右肾及肾动、静脉。于肾静脉后方向后游离输尿管，直至膀胱，暴露输尿管膀胱连接处。以输尿管开口为中心切取半径约3 mm的膀胱瓣。

    于腹主动脉分叉处头侧包绕主动脉和后腔静脉预置1根0号丝线，肾动脉前方1 cm预置2根0号丝线，分别包绕主动脉及后腔静脉。结扎、切断肠系膜上动脉，结扎、切断肾上腺动、静脉并留标记尾线。经阴茎背静脉注入肝素125 U后，分别结扎预置线，于腹主动脉分叉结扎线近心端插入静脉留置针，以4℃含肝素钠林格液灌洗双侧肾脏，灌注压力保持在80 cm H2O（7.85 kPa)，至双肾成均一浅土黄色、双肾静脉流出液清亮为止，迅速用冰屑覆盖双肾。齐主动脉壁处剪断左右肾动脉，齐后腔静脉管壁处剪断左肾静脉，平左肾静脉前缘及后腔静脉结扎线前方剪断后腔静脉，并将其修剪成右肾静脉的一部分。右肾静脉和后腔静脉的距离非常短，因不能很好的固定血管夹以至于行原位右肾静脉的端端吻合非常困难；又因大鼠肾静脉直径与后腔静脉直径相近，故我们将后腔静脉的一部分修整为肾静脉的一部分以延长右肾静脉，并将右肾放置左肾窝处，以便行右肾移植及肾静脉的端端吻合术。供肾置于盛有0～4℃肝素生理盐水的无菌冰盒中。

    1.2.3  受体手术  碘伏消毒，经正中切口进腹；肠、胃、脾用湿盐水纱布保护推向右上腹，充分暴露左肾及左肾动、静脉，固定。水分离法仔细解剖肾门处血管至后腔静脉、腹主动脉，充分显露左肾动、静脉及左肾上腺动、静脉；结扎、切断左肾上腺动、静脉并留标记尾线。近后腔静脉和腹主动脉的肾动、静脉处，血管夹阻断已游离的肾动、静脉，近肾门标记线外侧远端剪断肾动、静脉，肝素钠盐水冲洗血管断端及管腔内残存的血液，移除左肾（图1）。

    供肾置于受体左肾窝处、冰屑纱布覆盖。在10倍显微镜下先吻合静脉再吻合动脉。以肾上腺动脉断端标记线为缝合第一针的进针标志，行肾动脉两定点间断端端吻合，缝合8～10针；供、受体肾静脉三定点间断端端吻合，由于肾静脉较薄且易粘贴，故在肾窝处喷入生理盐水以将受、供体肾静脉浸入生理盐水，将肾上腺静脉断端标记线向头侧放置（右肾将后腔静脉结扎线结摆向头侧）；轻抖生理盐水中静脉管壁数次，静脉壁会自动散开，显露出静脉断端和管腔，以标记线为吻合标志，缝合12～16针（图2～4）。吻合完毕后，先用血管夹钳夹肾门血管，撤去肾静脉血管夹检查静脉吻合口，再撤去肾动脉血管夹检查动脉吻合口，待检查满意后，再开放肾门血管夹（图5、6），数秒内可见移植肾实质迅速充盈变红。动、静脉吻合口出血时可用小棉球持续轻压片刻，一般渗血均能停止，必要时补针。固定移植肾。切开膀胱侧壁2～3 mm，理顺输尿管，行输尿管膀胱瓣膀胱外隧道式吻合；受体右肾血管预置体外结扎线。

    1.2.4  术后处理  术毕，移植大鼠肌肉注射青霉素（50 U·g-1）；经阴茎背静脉按需足量补液。移植大鼠麻醉清醒后，即可进食。术后3 d，体外结扎右肾预留结扎线。

    2  结    果

    技术成熟后，共行40次肾移植实验。使用水分离法游离输尿管、肾动静脉，平均耗时12～15 min，较传统的棉球钝性分离减少手术耗时6～7 min。取肾耗时约40 min，移植手术耗时50～60 min。供肾热缺血时间10～20 s，左肾冷缺血时间35～40 min，右肾冷缺血时间65～70 min。肾动、静脉吻合完毕后，开放肾动、静脉，肾动、静脉即时通畅率分别为85%（34/40）、90%（36/40），吻合血管无扭转。血流恢复后，所有的血流通畅，移植肾均在1～3 min开始泌尿，术后3 d自体右肾结扎后仍有尿液排出，说明移植肾有功能。并发症有吻合口出血、休克、静脉血栓形成、术后腹腔感染、排斥反应等。

    3  讨    论

    大鼠肾移植模型为移植免疫学研究的重要工具。目前，国内外大多采用单侧供肾进行肾移植动物模型建立，应用双侧供肾者尚不多见。Yin等[3]于1994年首次采用供肾动脉带主动脉瓣、静脉带后腔静脉瓣分别与受体腹主动脉、后腔静脉行端侧吻合，输尿管带膀胱瓣与受体作DOM式吻合建立了大鼠双侧供肾移植模型。此术式需阻断主动脉和后腔静脉血流，以至大鼠无血流躯体易形成血栓，开放血流后血栓松动脱落导致肺静脉栓塞、心脏骤停，造成受体在术中及术后有较高的死亡率。Grau等[4]于2003年首先报道不阻断主动脉和后腔静脉血流的端端血管吻合双侧供肾大鼠原位肾移植模型。因建立移植肾血循环的公认难点没有解决，即离断的游离肾静脉呈现管壁粘贴、挛缩团皱，吻合时难分清其前后壁，易缝至对侧壁，易致吻合血管扭曲、瓶颈样狭窄，耗时长，以致很多学者不愿采用端端吻合肾静脉或采用支架物支撑静脉壁的方法进行肾静脉端端吻合。国内学者冯宁翰等[5?6]报道的大鼠双侧供肾原位移植，均须阻断腹主动脉血流和使用支架支撑肾静脉壁后再行动静脉血管端侧吻合术。

    Schumacher等[7]对近40年的研究发现，研究者采用复杂、费时的肾血管端端吻合法或端侧吻合法来建立移植肾的血液循环，而不采用CUFF管、支架等方法，其原因是虽然这些方法提高了吻合速度，但是术后血管狭窄、血栓形成等并发症的发生率均有升高，并不适合肾移植慢性排斥模型的建立。Pahlavan等[1]在2006年使用Medline检索到2 300余篇大鼠肾移植相关文章（1965?2005），统计结果显示,血管端端吻合所引起的血管并发症最少，肾动脉端端吻合是金标准,最为推荐肾静脉端端吻合。至此，解决肾静脉吻合困难这个公认难点是问题的关键所在。

    我们在实践中找了导致离断肾静脉吻合困难的原因并解决了问题。血管未游离及切断时，肾静脉内的血液对血管壁侧压力是维持肾静脉的充盈状态的主要原因。当肾静脉被阻断并切断后，维持静脉充盈的原因消失，外加大气压的作用致静脉管壁塌陷。塌陷的静脉管壁之间存在液体分子形成固相液相间的附着层黏附力，导致静脉壁相互粘贴。肾动静脉血管鞘、周围结缔组织的结构支撑力是维持肾静脉管壁保持正常形态的原因，当肾静脉周围的血管鞘和结缔组织被剥离后，加之液体表面张力大于菲薄静脉管壁的弹性阻力，导致菲薄的管壁回缩呈挛缩皱团状，其断端边缘不易辨认、分开，准确缝合难度较大，需时长（图1、7）。针对上述原因，我们将游离的离断肾静脉浸入生理盐水中，使得作用在血管表面的大气压力移至盐水表面，塌陷的静脉管壁之间充填大量水分子使得附着层黏附力消失，管壁可以在浮力的作用下漂浮（图2、3）；液体表面张力移至水面，静脉管壁的组织弹性恢复，挛缩团状自然消失，肾静脉极易吻合（图4）。吻合后血管无扭曲狭窄（图5、6）。

    图7  肾静脉壁呈塌陷粘贴、团缩皱襞（肾静脉已被缝合1针，×10）

    Fig 7  The walls of transected renal vein and artery are cohesive,wrinkle,tumbling(renal viens was sutured one stitch，×10）

    采用水分离法游离肾、肾血管可清晰显示后腹膜腔的层次结构，显露肾动脉微小分支、肾静脉微小属支，避免了因使用棉球和显微镊子钝性分离带来的不必要损伤和出血，减少了不必要的手术操作和时间。最重要的是使用这种无创分离技术分离肾、动静脉时，可避免因钳夹肾动、静脉管壁而导致的肾动脉痉挛，从而避免了移植肾缺血预适应的产生和动、静脉血栓的形成。水分离法游离单侧肾、肾血管平均使用时间12～15 min，手术时间较传统的钝性游离方法缩短了6～7 min，且不需要太多的显微外科手术技巧。这种无创伤的分离技术不需要特殊的仪器、器械，简单快速安全强效。

    大鼠左肾静脉前缘接受肾上腺后静脉和膈后静脉的混合支，右肾静脉仅接受肾上腺后静脉。左、右肾动脉前缘各发出1条肾上腺动脉下支入肾上腺[8]。无论供体还是受体，水分离法游离肾上腺动、静脉后，结扎剪断肾上腺动、静脉并留适当长度尾线，以作为吻合第1针的进针标记，减少血管吻合时对位的盲目性和随意性，保证了吻合时血管的正确对位及吻合血管无扭转。吻合血管时，标记尾线的方向均朝向头部放置，在两血管断端标记线的附近相似位置缝合第1针；二定点间断加针法吻合动脉，三定点间断加针法吻合静脉，以确保血管吻合时不发生扭转，避免动、静脉呈迂曲扭转状导致人为狭窄，局部血液涡流的形成（图4）。选用右肾在左肾窝移植，可节省实验经费和实验动物的用量。

    采用水分离法游离肾、肾血管的时间明显缩短，手术使用时间较传统的钝性游离方法缩短；在体修整、原位低温灌注，使热缺血时间≤15 s,相对于30 min的热缺血界限具有明显优势；两次肾移植冷缺血时间平均分别为40、70 min，整体手术时间与供受体1∶1移植两次手术相比，总体时间缩短了。

    总之，我们在生理盐水中行肾静脉的端端吻合建立的此肾移植模型，为我们肾移植实验提供了有利条件，节约了实验用动物、科研经费和手术时间，实用，稳定可靠，成功率较高，一般实验室均可开展。

【文献】
  [1]PAHLAVAN P S，SMALLEGANGE C，ADAMS M A，et al.Kidney transplantation in the rats:assessments,complications,and management[J].Microsurgery，2006，26:404?411.

[2]MARTINS P N A.Kidney transplantation in the rat:amodified technique using hydrodissection[J].Microsurgery，2006，26:543?546.

[3]YIN M，BOOSTER M H，van der BOGAARD A E，et al.A simple technique to harvest two kidneys from one donor rat for transplantation[J].Lab Anim，1994,28:387?391.

[4]GRAU V，STEINIGER B.Transplantation of both kidneys from one donor rat[J].Lab Anim，2003，37:162?165.

[5]冯宁翰，钱立新，华立新.一种双侧供肾大鼠肾移植模型的建立[J].中华器官移植杂志,2006，27：309?310.

[6]赵彦宗，岳中瑾，杜维成.双侧供肾大鼠原位肾移植模型的建立[J].比较医学杂志,2006，16：12?15.

[7]SCHUMACHER M，van VLIET B N，FERRARI P.Kidney transplantation in rats:an appraisal of surgical techniques and outcome[J].Microsurgery，2003，23：387?394.

[8]杨安峰，王平.大鼠的解剖和组织 [M].北京：出版社，1985:35?81.