涤痰化瘀法对高血压左心室肥厚模型大鼠心肌细胞凋亡的影响

                   作者：陈茹琴 熊平 周欣欣 梁兆球 吴良芝

【摘要】  【目的】观察涤痰化痰法对高血压左心室肥厚模型大鼠心肌细胞凋亡的影响。【方法】选用SPF级SD大鼠62只，随机分为5组：正常对照组，假手术组，中药低、高剂量组（分别按8.5、19.0g·kg-1·d-1剂量灌服涤痰化瘀方煎液）；后3组均采用二肾二夹法复制高血压模型，手术35d后各组按设计剂量连续给药60d；观察各组血压、左室质量及全心质量，检测各组大鼠左心室质量指数（wLV），观察各组大鼠心肌病理形态变化，并采用流式细胞术检测各组心肌细胞凋亡率。【结果】中药低、高剂量组虽可降低血压、左室质量及全心质量，但与模型组比较无显著性差异（P＞0.05）；两中药组均可显著性降低左心室质量指数和心肌细胞凋亡率（P＜0.05或P＜0.01），改善心肌组织的病理变化，防止心肌坏死和纤维化。【结论】涤痰化瘀法对高血压的作用可能与其能减少心肌细胞凋亡，逆转左心室重构，减少心肌坏死及纤维化有关。

【关键词】  高血压/中药疗法； 涤痰化瘀法/治疗作用； 心肌/病； 细胞凋亡； 疾病模型，动物； 大鼠

左心室肥厚(LVH)多见于高血压病的中晚期，可能是心脏对高血压的持续性负荷发生的一种慢性适应性过程，其发生机制目前尚未完全阐明。近年研究表明：高血压病的主要靶器官(心、脑、肾)中均存在细胞凋亡现象［1-4］，抗高血压药物如血管紧张素转换酶抑制剂、钙通道阻滞剂等则能影响机体靶器官的细胞凋亡［5-6］。中医学认为，LVH病机属本虚标实，本虚则气血运行不畅致气滞血瘀，水液不能正常敷布致痰浊阻络，同时，气滞血瘀和痰浊阻络可互为因果［7-8］。本研究观察了涤痰化瘀法对肾血管性高血压模型大鼠左心室重构、病理改变及心肌细胞凋亡的影响。现报道如下。

    1  材料与方法

    1.1仪器及试剂  Epics XL流式细胞仪(美国Beckman Coulte)；多参数细胞周期分析软件(MultiCycle Software，美国Coulter公司)；DNA Prep Kit(Beckman Coulter 公司)；胶原酶、胰酶、乙二胺四乙酸（EDTA）均购自Sigma公司；TP1020生物组织脱水机、EG1140石蜡包埋机、RM2135 轮转式石蜡切片机均由德国Leica公司生产；CS?IV型摊片烤片机（孝感市仪器厂）；CX41?OLYMPUS图像分析系统（日本OLYMPUS公司）；RBP?1B型大鼠血压计(中日友好临床医学研究所研制)。

    1.2中药及制备  涤痰化瘀方组成为陈皮9g、橘红9g、、法半夏9g、瓜蒌9g、枳壳9g、赤芍10g、川芎10g、丹参20g、桃仁5g、红花10g、枸杞15g、杜仲10g、炙甘草3g，由广州致信中药饮片有限公司提供。加蒸馏水适量煎煮2次，每次煮沸30min，合并滤出液，浓缩，密封，高温高压灭菌，4℃存放备用。

    1.3  动物与分组  SD雄性SPF级大鼠62只，体质量（80±10）g，由广东省医学实验动物中心提供，合格证：SCXK（粤）2003?粤监证字2006A015。动物随机分为5组，分别为正常对照组8只，假手术组10只，高血压模型组14只，中药低、高剂量组各15只。各组大鼠适应饲养3d后测血压、体质量，除假手术组和正常对照组外，其他各组均采用二肾二夹法复制高血压模型。手术35d后，中药低、高剂量组均灌胃给予涤痰化瘀方煎液，剂量分别为8.5、19.0g.kg-1.d-1，其他组给予等容积生理盐水，给药60d后，处死大鼠取材。

    1.4  高血压大鼠模型的复制［9］  术前给大鼠称体质量、测血压，用100g /L水合氯醛（3.5mL/kg）腹腔麻醉，仰卧位固定，剪去腹部手术野毛发，皮肤消毒后于剑突下1cm沿腹正中线切开皮肤及肌层，切口约1.5cm，切口两边铺放浸过生理盐水的纱布，钝性分离双侧肾动脉，用镊子取0.3mm的U型银夹将其垂直套入，待肾动脉落入银夹顶部的小孔内，用镊子锁闭银夹造成狭窄，手术避免损伤肾脏、肝脏、乳糜池及肾静脉。判断肾动脉的方法：将其提起后肾脏颜色由红褐色变灰白色，则为肾动脉。手术完成后，向腹腔内注射2mL的庆大霉素注射液，缝合肌肉与皮肤创口，连续3d常规肌注5U青霉素。术后血压大于术前的3个标准差且高于15.3kPa，则确定模型成立。假手术组游离肾动脉，不套银夹，正常对照组不手术。

    1.5  大鼠血压(SBP)的测量  采用尾袖法，每周测定大鼠清醒状态下的尾动脉收缩压。

    1.6  检测指标 

    1.6.1  左心室肥厚的主要指标  实验结束，将禁食12h的大鼠称体质量(mbody)，用100g/L的水合氯醛行腹腔注射，麻醉后开胸取出心脏，迅速置于4℃预冷生理盐水中冲洗血污，滤纸吸干称质量，沿房室交界处去除心房和大血管，去除右心室游离壁，分离左心室并称质量(mLV)，并左心室质量指数：wLV = mLV/mbody。

    1.6.2  病理学检查  常规取材，用体积分数为10%中性福尔马林液固定、脱水、包埋、切片、苏木素—伊红（HE）染色，显微镜下观察。

    1.6.3  心肌细胞凋亡率的测定  取新鲜心肌组织约50mg，以冷磷酸盐缓冲液（PBS）清洗组织残留血液。用眼科剪将组织剪成1mm3大小，2.5g/L胰酶?EDTA和0.25g/L的胶原酶将心肌组织消化成单细胞悬液，1 000r/min 离心5min，弃上清。重悬沉淀于冷PBS中，过300目滤网，细胞计数，调整细胞浓度为5×106/mL，1 000r/min离心5min；用体积分数为70%的乙醇固定，4℃过夜；检测前将保存的标本用PBS洗2次，按照试剂盒说明依次加入膜穿孔剂、碘化丙啶(PI)，室温避光染色20min，采用流式细胞仪进行凋亡细胞的检测。

    1.6.4  统计学方法  采用SPSS10.0统计软件进行统计分析。

    2   结果

    2.1  一般情况  术后大鼠共存活52只（其中假手术组死亡2只，手术组死亡8只，均为手术意外死亡）。术后第5周，造模各组血压皆明显升高，实验结束时，共存活48只，正常对照组存活8只，假手术组存活8只，模型组存活10只，低剂量组存活11只，高剂量组存活11只。死亡原因：模型组感染死亡1只，心力衰竭死亡1只； 低剂量组、高剂量组灌胃各死亡1只。

    2.2  各组大鼠血压、左心室质量指数的变化  表1结果表明，手术后，大鼠的血压有显著升高趋势，持续用药60d后，模型组与正常对照组血压比较有显著性差异(P＜0.01)，中药低、高剂量组血压、左室质量及全心质量均出现下降趋势，但无显著性差异（P＞0.05）。使用涤痰化瘀方后，中药低、高剂量组左室质量指数比模型组显著减少(P＜0.05)。表1  各组大鼠血压和左心室质量指数变化比较

    统计方法:方差分析；①P<0.05，②P<0.01，正常对照组比较；③ P<0.05，与模型组比较

    2.3  病检查结果  正常对照组（图1-a）、假手术组（图1-b）心肌细胞未见明显病理学异常。模型组（图1-c）出现高血压病理改变：灶性心肌细胞坏死，纤维组织增生、修复。中药低剂量组（图1-d）病变较模型对照组减轻，心肌未见坏死。中药高剂量组（图1-e）各器官病变轻微，心肌未见坏死。

    2.4  各组对高血压左心室肥厚大鼠心肌细胞凋亡的影响  表2结果显示，模型组心肌细胞凋亡率显著高于正常组（P＜0.01），经涤痰化瘀方干预后，中药低、高剂量组大鼠心肌细胞凋亡率与模型组比较显著下降(P＜0.01)，而与正常组及假手术组比较无显著性差异（P＞0.05），表明涤痰化瘀方药能显著改善高血压左心室肥厚大鼠心肌细胞凋亡率。表2  各组对高血压左心室肥厚大鼠心肌细胞凋亡情况统计方法：方差分析；①P<0.01，与正常对照组比较；②P<0.01，与模型组比较

    3  讨  论

    细胞凋亡又称程序性细胞死亡(programmedce death)，是一种不同于细胞坏死的主动性非炎症性细胞死亡过程，表现为细胞体积变小，胞膜发泡，核固缩，染色质聚集以及核内DNA降解等。细胞凋亡参与体内细胞数量的调节，在维持机体的正常生理功能和细胞群体的稳态中发挥重要作用。

    正常成年心肌细胞一般被认为是不再增殖的高度分化的终末细胞，在正常条件下心肌细胞不会产生凋亡现象。但是目前研究已经证实，心肌细胞在机械牵拉、压力负荷、缺血再灌注、细胞因子等各种刺激的作用下也会发生凋亡。Hamet等［10］最先提供了心肌细胞凋亡增加的证据。近期研究表明，在急性心肌梗死、心肌病和心力衰竭等病理状态下，心肌细胞存在细胞凋亡现象，且与病情的严重程度密切相关。最近Liu等［13］研究发现，心肌细胞凋亡存在于高血压左心室重构过程，且与心肌肥厚的严重程度相平行。细胞凋亡是左心室重构的重要前提。一方面，细胞凋亡本身可导致修复性的纤维化；另一方面，心肌细胞凋亡也导致有效收缩功能单位进行性丧失，存活心肌细胞的代偿功能增强，当超过一定限度失代偿后，即会引起存活心肌细胞的适应性不良肥大即细胞外基质的沉积和反应性间质纤维化。

    痰瘀相关理论目前已广泛应用于心脑血管疾病如冠心病、中风、肺心病等的［14］，研究证明［15］，痰瘀两证均可导致血液循环障碍和微循环障碍。而将其运用于高血压LVH的防治上，则是痰瘀相关理论研究的新领域。

    本研究病理检查结果显示：涤痰化瘀中药可明显逆转实验性高血压大鼠的心肌坏死和纤维化。流式细胞检测结果显示：在模型组大鼠左心室肌中检测出大量心肌细胞凋亡，提示心肌细胞凋亡参与了高血压病左心室肥厚的发生过程。而涤痰化瘀方药干预能降低血压并显著降低左心室质量指数，中药低、高剂量组的心肌细胞凋亡率均显著下降，说明涤痰化瘀方药能逆转高血压左心室重构、显著改善实验性高血压鼠左心室肥厚的心肌细胞凋亡率，提示涤痰化瘀方药可干预高血压左心室肥厚进程，改善高血压的预后。但涤痰化瘀方药改善实验性高血压鼠左心室肥厚的心肌细胞凋亡率的机理有待进一步研究。

【】
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