尿毒清胶囊及其拆方对5/6肾切除大鼠肾组织 TGF?β1mRNA表达的影响
作者：汤水福， 陈刚毅， 洪钦国， 林晓敏
【摘要】 【目的】观察尿毒清胶囊及其拆方对慢性肾功能哀竭（CRF）模型大鼠肾组织转化生长因子β1（TGF?β1）mRNA表达的影响。【方法】采用5/6肾切除法复制CRF大鼠模型，造模成功的SD大鼠随机分为模型组、黄芪组（剂量1.5g·kg-1.d-1）、丹参组（剂量为1g·kg-1.d-1）、大黄组（剂量为1g·kg-1.d-1）、黄芪丹参大黄组（剂量为1g·kg-1.d-1）、尿毒清组（剂量为1g·kg-1.d-1）；各给药组灌胃给药6周后，检测各组大鼠血清尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）水平，并采用逆转录聚合酶链反应检测各组大鼠肾组织TGF?β1 mRNA的表达水平。【结果】各给药组均可降低血清BUN、Scr水平，与模型组比较均有显著性差异（P＜0.05或P＜0.01），其中尿毒清组降低Scr水平作用优于大黄组（P＜0.05）；TGF?β1 mRNA在各组肾组织中均有不同程度的表达，其中模型组表达最强烈，尿毒清组和黄芪丹参大黄组表达最轻。【结论】尿毒清CRF的作用与其能下调TGF?β1 mRNA在肾组织中表达有关，且中药复方作用优于单味中药。
【关键词】 尿毒清胶囊/药； 慢性肾功能哀竭/中药疗法； 转化生长因子； 疾病模型，动物； 大鼠
既往研究表明［1］，慢性肾功能衰竭（CRF）的中医病机复杂多变，运用中药复方制剂尿毒清胶囊可以有效改善临床症状，降低血肌酐和尿素氮水平。本实验采用5／6肾切除法复制慢性肾功能衰竭大鼠模型，观察具有益气、化浊、活血之功的中药尿毒清胶囊及其主要拆方对模型大鼠肾功能、转化生长因子（TGF?β1）mRNA表达的影响。现报道如下。
1 材料与方法
1．1 动物及造模 清洁级SD大鼠70只，雌雄各半，体质量（230±20）g，由广东省医学实验动物中心提供。适应性饲养1周后，按Platt法［2］复制5／6肾切除大鼠慢性肾功能衰竭模型。
1．2 主要药物、试剂及仪器 尿毒清胶囊由广州中医药大学第一附属制剂室提供，黄芪、丹参、大黄均由广州中医药大学第一附属医院药剂科提供并由煎药室统一煎煮，真空包装，保存在4℃冰箱里备用；Trizol购自上海申能博彩；逆转录聚合酶链反应（RT?PCR）试剂盒购自Takara；琼脂糖由AGROSE西班牙分装；染色剂购于北京赛百盛公司；Beckman Synchron CX4全自动生化分析仪(美国Beckman?Coulter公司产品);GDS7600型凝胶成像及分析系统（英国UVP产品）。
1．3 分组及药物干预 造模2周后，将存活的56只大鼠随机分为黄芪组（剂量为1.5g·kg－1·d－1）、丹参组（剂量为1g·kg－1·d－1）、大黄组（剂量为1g·kg－1·d－1）、黄芪丹参大黄组（剂量为1g·kg－1·d－1）、尿毒清组（剂量为1g·kg－1·d－1）、模型组。各组自由进食普通饲料和饮水，连续6周。
1．4 肾功能水平的检测 造模成功后尾静脉取血、灌胃6周后眼眶取血，采用全自动生化分析仪检测血清肌酐(creatinine，Scr)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)的水平。
1．5 肾组织TGF?β1 mRNA的表达 实验主要分为RNA提取和RT?PCR。
1．5．1 RNA提取 采用Trizol试剂盒抽提总RNA。每100mg肾组织加1mL的Trizol，匀浆后转移至1.5mL的Eppendorf （EP）管中；加入200 μL氯仿，剧烈振荡混匀30s后，4℃、12 000r/min离心15min；将上清小心转移到一个新的EP管中，加入与上清等体积的-20℃异丙醇，静置30min后，4℃、12 000r/min 离心10min；移去上清，用体积分数75%酒精洗涤沉淀1～2次（每次1mL，4℃、10 000r/min离心5min）；室温放置5～10min，沉淀即为样品总RNA；沉淀用50μL无RNA酶（RNase）水溶解，并以紫外分光光度计检测RNA浓度及纯度。
1．5．2 RT?PCR法检测
引物的设计与合成：TGF?β1mRNA由上海申能博彩生物技术有限公司合成，上下游引物序列分别为：5，?GGACTACTACG CCAAAGAAG?3，， 5，?TCAAAAGACAGCCACTCAGG? 3，，引物扩增产物长度294bp。GAPDH上下游引物序列分别为：5，?AGATCCACAACGGATACATT?3，， 5，?TCCCTCAAGATTGTCAGCAA?3，，引物扩增产物长度307bp。
逆转录（RT） 各组样品按下列顺序加样：组织RNA1μg，Olig1μL；5倍Buffer4μg；40U/μL RNase Inhibitor1μL，5 U/μL 逆转录酶（AMV RTase）1μL。将各组PCR管置50℃温育15min，然后以94℃、2min灭活逆转录酶。取逆转录产物，按下列顺序加样：cDNA1μL；上游引物1μL；下游引物1μL；脱氧核者三磷酸（dNTP）Mixture5μL；10倍One Step RNA PCR Buffer5μL；RNase Free dH2O24μL；5 U/μL Taq1μL。按下列程序进行PCR扩增：94℃、3min；94℃、30s，60℃、30s，72℃、1.5min，共30个循环后72℃、10min延伸。
取PCR产物20μL与上样缓冲液5μL混匀后，在16g/L琼脂糖凝胶上进行电泳。采用凝胶成像及分析系统对电泳图像进行光密度扫描，样本目的基因的相对表达量。
1.6 统计方法 采用SPSS10.0统计软件进行统计处理。
2 结 果
2．1 各组大鼠肾功能的比较 表1结果显示：各给药组Scr、BUN水平与模型组比较均显著性下降（P＜0.05或P＜0.01），其中尿毒清组降低Scr水平作用优于大黄组（P＜0.05）。表1 各组大鼠肾功能的比较统计方法：t检验；①P＜0.05，②P＜0.01；与模型组比较；③P＜0.05，与尿毒清组比较
2.2 各组TGF?β1mRNA基因的表达量 以表达稳定的内参GAPDH基因表达量为基准（设定为1），以各组样品表达量相当于GAPDH基因表达量的多少比较样品间的差异，结果见图1。各组TGF?β1mRNA基因表达量大小依次为模型组（0.78）、大黄组（0.74）、黄芪组（0.62）、丹参组（0.31）、黄芪大黄丹参组（0.13）和尿毒清组（0.11）。
3 讨 论
慢性肾功能衰竭的发病机理复杂多变，主要是正虚邪实，正虚包括五脏气血阴阳虚衰，而根本是脾肾虚衰，邪实有风、湿、热、毒、痰、浊、瘀等，而关键是浊瘀［3］。尿毒清胶囊主要由黄芪、大黄、丹参、半夏、枳壳、竹茹、土茯苓等组成，具有扶正益气、祛浊解毒、化瘀生新作用，切中慢性肾功能衰竭的中医病机。尿毒清在临床使用多年，有较好的疗效，能明显改善患者临床症状，降低Scr、BUN水平，提高内生肌酐清除率［4 ］。为比较中药复方制剂尿毒清与其主要拆方包括扶正益气中药黄芪、祛浊解毒中药大黄和化瘀生新中药丹参的疗效，本研究着重观察上述各组药物对大鼠肾组织TGF?β1mRNA表达的影响方面，以揭示其作用机理。
在慢性肾功能衰竭肾纤维化过程中，体内会产生多种生长因子、细胞因子及血管活性物质，其中TGF?β1是最重要的致纤维化因子。TGF?β1具有多种生物学功能，其中以在组织器官免疫以及非免疫损伤后瘢痕和纤维化形成过程中的作用最令人关注，是迄今为止所发现的在纤维和结缔组织基质发生过程中最为重要的细胞因子［5～7］。本研究结果显示，以泄浊解毒为主、兼益气活血组成的尿毒清胶囊，可以明显降低5/6肾切除大鼠模型Scr、BUN水平，与模型组比较有显著性差异（P＜0.01）。同时观察到，TGF?β1mRNA在各组肾组织中有不同程度的表达，其中模型组表达最为强烈，尿毒清组和黄芪丹参大黄组表达最轻。 提示中药CRF的分子作用机理之一可能与通过下调TGF?β1mRNA在肾组织中的表达，减轻或延缓肾脏纤维化，保护肾功能有关。而中药复方下调TGF?β1mRNA在肾组织中表达的作用要比单味中药好，这与既往的临床研究和动物实验生化结果相吻合［8］，进一步从分子水平上证实了中药复方尿毒清胶囊的作用机理，并论证了CRF脾肾虚衰、浊瘀内阻的中医病机。
【】
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