九香止泻肠溶片对副溶血弧菌活性及小肠功能亢进模型小鼠的影响

                       作者：彭芝配，滕久祥，尹进，伍参荣

【摘要】  目的 探讨九香止泻肠溶片对副溶血弧菌活性以及对新斯的明所致的小鼠小肠功能亢进影响。方法 采用琼脂扩散法测定抑菌圈直径，液体培基测定法与平皿倾注法测定最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）；皮下注射甲硫酸新斯的明0.15 mg/kg造模，灌胃10％炭末生理盐水，测定小肠推进率。结果 九香止泻肠溶片在50 mg/mL浓度对副溶血弧菌表现出较强的抗菌作用，其作用优于肠康片（P<0.01），其MIC为50 mg/mL,MBC为500mg/ mL；与模型组比较，九香止泻肠溶片各剂量组小肠推进率显著降低（P<0.05）；其中、高剂量组明显优于肠康组（P<0.05）。结论 结果提示九香止泻肠溶片具有显著的抗副溶血弧菌活性、抑制小肠功能亢进作用。

【关键词】  九香止泻肠溶片；海洋弧菌；抗菌；新斯的明；小肠推进率；小鼠；秦皮；香椿皮

    急性腹泻的发病原因多为感染性腹泻，细菌感染引起的腹泻占感染性腹泻多数。致泻性海洋弧菌引起的急性腹泻发病率呈上升趋势。副溶血弧菌就是其中一种致泻性海洋弧菌。九香止泻肠溶片主治湿热泻泄，其临床疗效确切、安全。拟九香止泻肠溶片对副溶血弧菌抗菌活性影响及其对新斯的明引起的小鼠小肠功能亢进模型的影响进行研究。现将实验方法及结果报告如下。

    1 材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  药物  九香止泻肠溶片干浸膏由湖南中医药大学药学院药剂教研室提供。药品浓度为每克浸膏含5 g生药,批号：20050811，临床推荐剂量为3 g生药/次，3次/d，3 d为1疗程。肠康片，湖南湘泉制药有限公司生产，批号：20050201。诺氟沙星胶囊，福建古田药业有限公司生产，批号：060106-4。甲硫酸新斯的明注射液，上海信谊金朱药业有限公司生产，批号：030501。

    1.1.2  动物  昆明种小鼠, 雌雄各半，体质量18～22 g，由湖南农业大学动物科技学院实验动物养殖场提供。许可证号码: SCXK(湘)2003-0003。实验用小鼠均在日常条件下饲养 3 d 后进行试验。

    1.1.3  菌种  副溶血弧菌由湖南省商品进出口检验检疫局食品检验检疫科提供,购自大连海事检验中心，批号：20050603。

    1.1.4  试剂与仪器  琼脂；NaCL；墨汁；无菌注射用水；生物显微镜；超净工作台；血球计数板；抗菌实验用琼脂打孔器（Φ6 mm）；柳叶刀；游标卡尺等。

    1.2  方法

    1.2.1  九香止泻肠溶片对致泻性海洋弧菌的检测方法[1]  （1）菌液制备 将副溶血弧菌菌种在3.5％ NaCl肉汤琼脂培养基中增菌，37℃培养，取对数生长的菌液。使用时用麦氏计数法，将菌液浓度调整为1×109个/mL。（2）抑菌实验  采用琼脂扩散法（打孔法）。制备我妻氏血琼脂平板，无菌检查后，进行抗菌实验：取0.1mL副溶血弧菌菌液（菌液浓度为1.5×109cfu/ mL）均匀涂布整个培养基表面，用直径6 mm无菌打孔器在我妻氏血琼脂平板的表面打孔，每个平板上打3孔，各孔中心相距约24 mm，每孔加入300 μL药液（药液浓度为1 g/mL），于37 ℃培养24 h后，观察抑菌圈的有无，用游标卡尺准确量取抑菌圈直径。同样操作重复9次。同时设诺氟沙星胶囊和肠康片对照孔。（3）药物的MIC测定  ①采用液体培基测定法测定药物的MIC. 制备3.5% NaCl肉汤培养基：NaCl 3.5 g加入布氏肉汤培基 100 mL中即得。加热溶解，分装于试管，每管1 mL，121 ℃、1.05 kg/cm2高压灭菌15 min备用。②将九香止泻肠溶片无菌干粉用注射用无菌用水溶解成1 g/mL，实验用3.5% NaCl肉汤培养基将药液进行对倍稀释1∶2，1∶4，1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512，1∶1024，共10管。同时设含菌不加药的菌液对照，加药不加菌的药物对照，不加菌不加药的培养基对照。③每管加入0.05 mL副溶血弧菌菌液，37 ℃、24 h培养，肉眼观察，以能抑制细菌生长的最高药物稀释倍数即为最低抑菌浓度（MIC）。（4）药物的MBC测定  取MIC以上无细菌生长的培养物0.1 mL，倾注于不含药物的我妻氏血琼脂培养基，待培基冷凝后，37 ℃培养24 h，观察有无细菌生长，以无菌生长的浓度即为药物的最低杀菌浓度（MBC）。

    1.2.2  九香止泻肠溶片对新斯的明所致的小鼠小肠功能亢进的实验方法[2]  （1） 动物分组及给药方法  取小鼠60只，雌雄各半，编号、称体质量后，按体质量排序，性别、体质量分层后按随机数字表法随机分为6组：空白对照组、模型组、肠康片组、九香止泻肠溶片低、中、高剂量组。每组10只。九香止泻肠溶片低、中、高剂量组分别以相当于临床等效剂量1、3、9倍浓度（1.17 g/kg、3.51 g/kg、10.53 g/kg）给药，肠康片组以相当于临床等效剂量3倍浓度给药（0.94 g/kg），小鼠灌胃体积为：20 mL/kg。实验前小鼠禁食不禁水24 h，实验开始各组均按出的剂量分2次灌胃相应药物给药，给药间隔4 h。空白对照组和模型组灌胃同体积蒸馏水。模型组与各治疗组每只小鼠均皮下注射甲硫酸新斯的明0.15 mg/kg。15 min后，各组小鼠均灌胃10％炭末生理盐水，体积为10 mL/kg，20 min后处死，测量每组小鼠小肠长度和炭末前端至幽门的推进距离，计算炭末在小肠的推进率。（2）检测指标  小鼠小肠长度、炭末推进长度、计算小肠推进百分率P＝小肠炭末推进长度（cm）/小肠全长(cm)×100％。百分率数据进行数据转换，以百分率的平方根的反正弦数值为统计指标。

    1.2.3  统计学分析  所有资料均经SPSS11.5统计软件进行统计学分析。

    2 结果

    2.1  九香止泻肠溶片对致泻性海洋弧菌活性的影响

    2.1.1  抑菌实验  结果显示，九香止泻肠溶片组抑菌圈直径显著大于肠康片组（P<0.01）；九香止泻肠溶片组、肠康片组抑菌圈直径小于诺氟沙星胶囊组，差异具有统计学意义（P<0.05）。结果见表1。

    2.2.2  MIC及MBC测定  结果显示，九香止泻肠溶片干浸膏对副溶血弧菌的MIC为50 mg/mL；MBC为100 mg/mL。肠康片MIC为500 mg/mL；诺氟沙星胶囊MIC为5 μg/mL。九香止泻肠溶片在一定浓度下对副溶血弧菌表现出了较强的抗菌作用。实验拍照如图1。

    2.2  九香止泻肠溶片对新斯的明所致的小鼠小肠功能亢进的影响 

    实验结果显示，模型组与空白对照组比较，小肠推进率明显提高，差异具有统计学意义（P<0.05）；肠康片组、九香止泻肠溶片低剂量组、中剂量组、高剂量组与模型组比较，小肠推进率明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05）；九香止泻肠溶片中剂量组、高剂量组与肠康片组比较，小肠推进率明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05）；见表2。

    3 讨论

    九香止泻肠溶片主要由秦皮、香椿皮等组成的复方。秦皮苦、辛，平，具有清热、解毒、止痢、明目等功效。主治泄泻，痢疾，白带，目赤等[3]。药理研究证实，秦皮苦、辛，平，具有清热、解毒、止痢、明目等功效。秦皮挥发油具有抗菌消炎、抗肿瘤的生物学活性。椿皮苦、涩、寒，具有清热燥湿，收涩止带，止泻，止血，杀虫之功效。临床主要用于湿热泻痢，赤白带下，久泻久痢，肠风便血，崩漏带下，外用可燥湿杀虫止痒，治疮癣[3]。香椿皮主要含川楝素、甾醇、鞣质等。其主要成分为臭椿苦内酯等，现代药理研究证明，香椿煎剂可以抑制和杀灭金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌、伤寒杆菌、痢疾杆菌等[4]。本实验结果提示，实验平皿肉眼可见明显的抑菌圈，九香止泻肠溶片对副溶血弧菌的MIC是50 mg/mL；MBC是100 mg/mL，说明九香止泻肠溶片对副溶血弧菌有明显的抑菌作用。 前期我们已经做了九香止泻肠溶片对痢疾杆菌、大肠杆菌等常见相关细菌的抑菌实验，结果表明抑菌作用显著，相关实验将在其它发表。而细菌感染是引起急性腹泻的主要病因。提示九香止泻肠溶片可能通过抑制或杀灭致泻性细菌从而达到止泻之目的。

    新斯的明具有抗胆碱酯酶作用，能可逆性的与胆碱酯酶结合，使内源性乙酰胆碱（Ach）在体内堆积，表现出Ach作用。因尚能直接作用于骨骼肌细胞的胆碱能受体，故对骨骼肌作用较强；缩瞳作用较弱。多用于重症肌无力及腹部手术后的肠麻痹[5]。在本实验中我们利用其作为肠功能亢进的造模药物。实验结果显示，九香止泻肠溶片低、中、高剂量组与新斯的明模型组比较，小肠推进率明显降低，差异具有统计学意义（P<0.05），说明九香止泻肠溶片具有抑制新斯的明引起的肠功能亢进的作用。

    近年来应用少数民族特色中草药急性腹泻的报道逐渐增多，其应用前景较为广泛，因此，九香止泻肠溶片是根据少数民族名老中医应用多年的经验方而制成之制剂，临床应用多年疗效对比观察，提示该药对于湿热泻泄具有非常好的疗效。前期动物毒性实验研究提示其长期口服安全，无明显毒副作用，推荐的临床使用剂量基本安全，无毒副作用[6]。本实验研究提示该药具有良好的抗菌、消炎等作用，为应用于临床提供了可靠的理论及实验依据。

【】
  [1] 张卓然.医学微生物实验学[M].北京:科学出版社,1998:26-28,57,216.

[2] 徐叔云,卞如濂,陈 修.药理实验方法学[M].第三版.北京:人民卫生出版社,2003:1343.

[3] 江苏新医学院.中药大辞典[M]．上海：上海人民出版社，1997，1793,2429-2430.

[4] 朱育凤,周琴妹,丰国炳,等.香椿皮与臭椿皮的体外抗菌作用比较[J].现代应用药学，l999，16（6）：19-21.

[5] 李 端. 药[M]. 北京：人民卫生出版社，2002，64-65.

[6] 尹 进，彭芝配，滕久祥,等. 九香止泻肠溶片长期口服对大鼠生理机能及相关指标的影响[J].湖南中医药大学学报，2006，26（6）：18-22.