白藜芦醇甲基化衍生物对兔骨关节炎模型关节液及血清NO和iNOS水平的影响

                       作者：童敏，高戈，高洁生，向大雄

【摘要】  目的 探讨白藜芦醇甲基化衍生物(BTM)对兔骨关节炎（OA）模型关节液及血清中NO和iNOS水平的影响。方法 36只健康新西兰兔随机分为正常组、模型组、阳性组和BTM高、中、低剂量组。模型组和阳性组、BTM组用Hulth法复制出实验性骨关节炎模型，术后8周造模成功。正常组、模型组用生理盐水2 mL/kg、阳性组用双醋瑞因4.6 mg/kg、BTM组用BTM高剂量120 mg/kg、中剂量60 mg/kg、低剂量30 mg/kg灌胃，连续用药4周后处死兔并切取股骨内髁软骨作光镜观察，测定骨关节液和血清中NO、iNOS含量。结果 光镜下模型组兔关节软骨呈明显退行性变，BTM组较模型组有显著修复作用。BTM组关节液和血清中NO、iNOS水平显著低于模型组（P﹤0.05），阳性组和BTM组关节液和血清中NO、iNOS水平无显著性差异（P>0.05）。结论 BTM能够降低骨关节炎模型兔关节液及血清中的NO和iNOS的水平，抑制骨关节炎的发生和。

【关键词】  膝骨关节炎；白藜芦醇甲基化衍生物；NO；iNOS；兔

    白藜芦醇（resveratrol，Res，3，5，4，-三羟基-反-均二苯代乙烯）属非黄酮类多酚化合物，研究证实富含Res的植物多达21个品种，有31个属72种植物，如葡萄、花生、决明、虎杖等[1]。[2]证实白藜芦醇具有抗炎、抗氧化、抗自由基、抗癌及改善微循环等重要作用。骨关节炎（Osteoarthritis, OA）是一种退行性关节疾患，也是影响老年人生活质量最常见的骨关节病，是由多种细胞因子和炎性因子参与且以关节软骨破坏为主的病理过程。越来越多的证据表明，一氧化氮（NO）与OA的发病机制密切相关，抑制NO的产生，可以延缓OA的进程。白藜芦醇的以上药理作用对骨关节炎的病情改善具有多靶点、标本兼治的优势。由于白藜芦醇半衰期短，其在治疗骨关节炎方面的研究又极少，所以我们合成了白藜芦醇甲基化衍生物（BTM），研究其对骨关节炎模型兔关节液及血清中的NO和iNOS水平的影响，探讨BTM对骨关节炎的部分作用机制。现将实验方法及结果报道如下。

    1 材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  动物  健康新西兰兔（中南大学湘雅二院实验动物室提供）36只，雌雄各半，体质量1.5~2 kg。合格证号：SCXK（湘）2006-0001。

    1.1.2  药物  白藜芦醇甲基化衍生物（BTM，中南大学湘雅二院药剂科自制，纯度98.5%，061124）；双醋瑞因胶囊（阳性药物，TRB PHARMA S.A.20050515）。根据成人用药量与实验动物用药的换算公式，出每只兔每天用BTM 120 mg/kg，配成浓度60 mg/mL的溶液，每只兔每天用双醋瑞因4.6 mg/kg，配成浓度4.6 mg/mL的溶液。

    1.1.3  试剂与仪器  NO测定试剂盒（20060630）、NOS测定试剂盒（20061228）南京建成生物工程研究所第一分所；NiKon YS700型显微镜；LEICA RM 2135切片机；YT-6C生物组织摊片机；LEICA TP 1020全自动脱水机；722型光栅分光光度计（上海第三分析仪器厂制造）（86）量制沪字00000143。

    1.2  方法

    1.2.1  动物分组与造模  取新西兰兔36只，随机分为6组，每组6只。除对照组外，30只兔参照文献方法[3]，建立Hulth模型。取兔用3％的戊巴比妥钠按1 mL/kg耳缘静脉注射麻醉，固定于手术台，取右后肢膝关节内侧副韧带、前交叉韧带，完整切除内侧半月板，逐层缝合伤口，无菌敷料及绷带包扎固定。术后每兔肌注40万U/kg青霉素，1次/d，注射5 d。兔单笼饲养，自由进食、饮水。

    1.2.2  给药方法  术后8周开始按体质量灌胃：对照组和模型组给生理盐水5 mL/d，双醋瑞因组4.6 mg/（kg·d），白藜芦醇高剂量组120 mg/(kg·d)、中剂量组60 mg/(kg·d)、低剂量组30 mg/（kg·d），灌胃给药，每天1次，给药4周。灌胃前后均摄兔膝关节X片以备观察比较。

    1.2.3  NO、NOS测定  给药4周后取标本：将兔麻醉，造模膝关节剪毛，消毒，用1 mL生理盐水冲洗关节腔，抽出冲洗液，3 000 r/min离心10 min，取上清液；自兔耳缘静脉取血10 mL，取血清；用硝酸还原酶法测定关节液和血清中NO、NOS含量[4]，严格按试剂盒说明进行操作，在紫外分光光度仪550 nm波长处比色，记录吸光度。

    1.2.4  光镜标本制备  兔处死后立即切开膝关节，做大体观察，后以锐利刀片切取股骨内髁软骨，修成1 mm×1 mm×1 mm的全软骨层标本置于10%甲醛固定，系列脱水、10% EDTA脱钙10 d，常规石蜡包埋，切片，HE染色，以备光镜观察。

    1.3  统计学分析

    实验数据采用SPSS10.0统计软件处理。各组数据采用(ｘ±ｓ)表示，组间差异用双侧t检验。

    2 结果

    2.1  BTM对骨关节炎模型兔膝关节X线观察

    正常组膝关节内外侧间隙均匀一致，股骨髁、胫骨平台关节面轮廓清晰、光整。模型组膝关节胫骨平台关节面不光整，内侧间隙明显变窄，外侧间隙增大，膝关节失稳。阳性组膝关节内侧间隙变窄，外侧间隙增大。BTM组膝关节内侧间隙稍变窄，外侧间隙增大稍宽，与模型组相比股骨髁、胫骨平台关节面尚光整。

    2.2  BTM对骨关节炎模型兔关节软骨肉眼观察

    正常组膝关节软骨外观呈蓝灰色，色泽明亮，无裂纹及软化，触之较硬。模型组关节软骨触之较软，尤以股骨内髁较明显，明显失去原有光泽、发黄，色泽变暗淡，滑膜存在不同程度增生、粘连，关节液量增多，且呈泡沫状、浑浊，未见明显骨赘形成。BTM组可见关节软骨外观呈白色，较光滑，股骨内髁触之变软，滑膜轻度增生，炎性表现也较模型组轻，BTM组关节软骨状况明显优于模型组。

    2.3  兔关节液和血清中NO、NOS测定结果比较

    NO、iNOS在骨关节液、血清中均有明显表达，OA动物模型组兔关节液、血清中NO、iNOS的水平显著高于正常组(P<0.05）。BTM组与阳性组比较差异无统计学意义(P>0.05），BTM组NO、iNOS水平低于模型组，两组比较差异有统计学意义（P﹤0.05），高、中、低剂量组之间比较差异无统计学意义，见表1。

    2.4  关节软骨切片光镜观察结果　

    (1)正常组：软骨表面光滑，由浅入深可分为表浅层、移行层、放射层、钙化层，软骨细胞排列成柱状，未见软骨细胞簇，潮标线完整（图1①）。（2）模型组：表面出现多个空隙窝，软骨细胞消失，部分软骨细胞固缩，软骨表面不光滑，出现多个裂隙，部分软骨剥脱，形成缺损区。偏于一侧，关节面有压痕，深层出现软骨细胞簇积现象，软骨下骨板增厚（图1②）。（3）阳性组：软骨表面较光滑，软骨增生，表面出现部分空隙窝，柱状排列较明显（图1③）。（4）BTM组：软骨表面有表浅裂隙，软骨细胞柱状排列较整齐，软骨数目多，关节面较整齐，潮标线较完整（图1④～⑥）。

    3 讨论

    骨关节炎（OA）是一种退行性关节疾患，主要表现为关节肿痛和不同程度的功能障碍，严重时导致功能丧失[5]。考虑到OA系多种病因导致的关节间应力不均且具有关节软骨的退行性变和继发性骨质增生这一发病特点，本实验采用Hulth造模方法，8周即可成骨性关节炎模型[6]，其具有随造模时间延长，软骨退变逐渐加重的特点。本实验中发现：术侧膝关节普遍出现了骨性肥大，滑液混浊，关节边缘出现大量骨赘，符合OA大体表现，实验结果证实了这一方法确能导致骨关节炎的形成。Hulth认为此模型所出现的病损与临床骨性关节炎所见的改变为同一类型,8周后即出现较明显的软骨退变。

    软骨退变磨损、骨质硬化、囊变、骨赘、关节肥大变形构成了骨关节炎的病理核心，导致一系列与之相关的临床症状。本文结果显示：从标本可以观察到模型组兔膝关节明显退变，软骨表层明显缺失，关节软骨溃疡，软骨细胞紊乱和软骨细胞丢失，纤维化及少量骨赘形成等，符合骨关节炎的病理改变。药物组在病理程度上的改变明显较模型组轻，软骨表面裂纹少，胶原纤维结构基本完整，固缩的软骨细胞较少，虽可见部分退变软骨细胞，但部分软骨细胞具有较多细胞器，这些都表明软骨细胞通过增强合成和分泌功能来修复软骨。

    一氧化氮（NO）是OA发病过程中的重要炎症介质，是一种新发现的生物信息递质，在软骨损伤中起重要作用。NO是结构简单的无机小分子，半衰期很短，越来越多的证据表明[7]，NO与OA的发病机制密切相关，抑制NO的产生，可以延缓OA的进程。在体内，NO是由一氧化氮合成酶(NOS)作用于L-精氨酸产生的。NOS有结构型(cNOS)和诱导型(iNOS)之分，其中在关节软骨中起作用的是iNOS。骨关节炎关节液中NO的产生主要来源于关节软骨细胞和滑膜细胞，关节中增加的炎性因子刺激软骨细胞和滑膜细胞iNOS的表达，产生NO, iNOS抑制剂能明显减轻OA软骨的损伤程度，说明iNOS是NO生产过程中的关键酶，对NO的合成及其生物功能的发挥具有重要意义。大量的NO可进一步促进前炎症细胞因子释放，从而抑制软骨细胞分泌细胞外基质和合成Ⅱ型胶原，影响软骨的营养交换，使其出现恶性循环、进行性退化。NO也是一种重要的炎症介质，在炎症反应的许多环节发挥复杂的调节作用。白藜芦醇可降低大鼠气囊炎中NO含量，因此抑制NO的生成可能是白藜芦醇抗炎作用机制之一[8]。本研究结果表明：NO、iNOS在骨关节液、血清中均有明显表达，OA动物模型组兔关节液、血清中NO、iNOS的水平显著高于正常组。BTM组与阳性组比较差异无统计学意义(P>0.05），BTM组NO、iNOS水平低于模型组，两组比较差异有统计学意义（P﹤0.05），高、中、低剂量组之间比较差异无统计学意义，说明BTM有可能抑制骨关节液和血清中NO的合成，使其对软骨的损害减少并使其它一些因子难以发挥协同作用，并明显延缓软骨退变进程。因此作者认为BTM能够降低骨关节炎模型兔关节液及血清中的NO和iNOS的水平，抑制骨关节炎的发生和，有可能成为改变OA进程的有效药物。以上所述尚局限于基础实验研究阶段，真正过渡到临床还有许多困难和需要解决的问题，值得进一步临床研究。

【】
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[3] 何炳书，刘世清，彭 昊，等.四环素对兔膝骨关节炎的保护作用[J].老年学杂志，2004，1(24)：37.

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