肺岩宁方下调裸鼠人肺腺癌细胞移植瘤中磷酸化Akt和缺氧诱导因子1α蛋白表达
作者：张铭, 徐振晔, 白冰, 董昀
【摘要】 观察肺岩宁方对人肺腺癌细胞A549裸鼠移植瘤中缺氧诱导因子?1α（hypoxia inducible factor?1α，HIF?1α）表达的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（Akt）信号调节的影响。方法：32只A549荷瘤裸鼠随机分为4组：模型组、顺铂组、肺岩宁方组和综合（顺铂加肺岩宁方）组，每组8只。化疗组和综合治疗组于第1、3、5天腹腔注射顺铂各0.1 mg，肺岩宁方组和综合治疗组予肺岩宁方0.4 ml灌胃，持续21 d。观察抑瘤率，逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT?PCR）检测移植瘤中HIF?1α mRNA表达，免疫组化法检测移植瘤中HIF?1α和磷酸化Akt（phosphorylated Akt, p?Akt）蛋白表达。结果：肺岩宁方组裸鼠抑瘤率为34.17%，综合治疗组为64.38%。RT?PCR结果显示，综合治疗组HIF?1α mRNA的表达水平低于模型组（P<0.05）。免疫组化实验显示，化疗组、肺岩宁方组和综合治疗组移植瘤HIF?1α蛋白表达均明显低于模型组（P<0.01）；肺岩宁方组和综合治疗组p?Akt蛋白表达明显低于模型组（P<0.05）。结论：益气养精法为主的肺岩宁方可抑制肺癌肿瘤生长，并与顺铂有协同作用。肺岩方对HIF?1α蛋白表达的抑制作用可能与下调p?Akt表达有关。
【关键词】 益气养精; 肺岩宁方; 人肺腺癌A549; 缺氧诱导因子1, α亚基; 丝氨酸苏氨酸蛋白激酶; 裸鼠
Objective: To observe the effects of Feiyanning Decoction, a compound traditional Chinese herbal medicine, in inhibiting the growth of transplanted A549 tumors in nude mice and the expressions of p?Akt and HIF?1α in A549 tumors. Methods: Thirty?two nude mice were transplanted with human lung adenocarcinoma cells (A549 cells) to make the mice model, and then randomly divided into four groups: untreated group (n=8), diamminedichloroplatinum (DDP) group (n=8), Feiyanning group (n=8) and DDP plus Feiyanning group (n=8). The nude mice in DDP group and DDP plus Feiyanning group were treated with DDP 0.1 mg by peritoneal injection on the 1st, 3rd and 5th day after model establishment. The nude mice in the Feiyanning group and the DDP plus Feiyanning group were treated with Feiyanning Decoction for 21 days. Reverse transcription polymerase chain reaction (RT?PCR) was used to detect the expression of HIF?1α mRNA in tumors, and immunohistochemical method was used to detect the expressions of p?Akt and HIF?1α proteins in tumors. Results: The inhibition rates of tumor in Feiyanning group and DDP plus Feiyanning group were 34.17% and 64.38% respectively. RT?PCR showed that the expression level of HIF?1α mRNA in DDP plus Feiyanning group was lower than that in the untreated group (P<0.05). Immunohistochemical staining showed that the optical density (OD) indexes of HIF?1α in DDP group, Feiyanning group and DDP plus Feiyanning group were lower than that in the untreated group (P<0.01). The expressions of p?Akt in the Feiyanning group and DDP plus Feiyanning group were lower than that in the untreated group either (P<0.05). Conclusion: Feiyanning Decoction is effective in inhibiting the growth of lung cancer. And the effect of inhibiting the expression of HIF?1α protein by Feiyanning Decoction may correlate with down?regulation of p?Akt.
Keywords: reinforcing qi and nourishing jing; Feiyanning Decoction; human lung adenocarcinoma cell strain; hypoxia inducible factor 1, alpha subunit; Akt; nude mice
缺氧诱导因子（hypoxia inducible factors，HIF）是一类转录因子，HIF?1α可以调节许多靶基因，促进肿瘤的血管生成、细胞增殖以及肿瘤转移等，磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase, PI3K）?丝氨酸苏氨酸蛋白激酶中Akt信号的活化可使HIF?1α蛋白合成增加［1］。肺岩宁方是徐振晔教授研制的具有防治肺癌侵袭转移作用的经验方，本研究旨在观察肺岩宁方对A549裸鼠移植瘤中HIF?1α表达的Akt信号调节的影响，探求该方抑制肿瘤生长的可能作用靶点。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物及细胞株
Balb/C裸鼠32只，雄性，8周龄，体质量（14±2）g，购于上海西普尔?必凯实验动物有限公司，许可证号为SYXK（沪）2005?0002。饲养于上海中医药大学龙华实验中心SPF级动物房，室温25 ℃，湿度70%，自由进食与饮水。人肺腺癌细胞株A549购于院上海细胞生物学研究所。培养于含10％胎牛血清（fetal calf serum, FBS）的RPMI 1640的细胞培养基，37 ℃、5％ CO2、饱和湿度培养。
1.1.2 实验仪器
DU800紫外分光光度仪购于美国Beckman公司，T?Gradient聚合酶链式反应 （polymerase chain reaction, PCR）仪购于德国Biometra公司，凝胶成像分析系统购于美国Alpha公司。
1.1.3 主要药材和试剂
肺岩宁方由生黄芪、白术、七叶一枝花、蜂房、黄精、山萸肉、仙灵脾和灵芝等组成，由龙华医院中药房提供。常规水煎，浓缩至生药含量为2.0 g/ml，4 ℃保存。顺铂（diammine?dichloroplatinum，DDP），20 mg/瓶，齐鲁制药厂产品，批号为04090352。RNA提取液TRIzol为北京天为时代科技公司产品，逆转录（reverse transcription, RT）反应试剂盒为上海晶美生物工程有限公司产品，Ampli?Taq DNA聚合酶为上海生物化工有限公司产品，兔抗人HIF?1α和磷酸化Akt（phosphorylated Akt, p?Akt）单克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品，免疫组化SP试剂盒为美国Zymed公司产品。
1.2 实验方法
1.2.1 动物模型制备及给药
A549细胞悬液0.1 ml（含细胞数目5×106个），注射于裸鼠右腋部皮下。裸鼠按随机数字表法分为模型组、DDP组、肺岩宁方组和综合治疗组（DDP+肺岩宁方），每组8只。2周后观察到裸鼠皮下有小结节长出，成瘤率100%，开始给药，给药剂量根据人鼠体表面积折合法。模型组：生理盐水0.4 ml灌胃21 d。化疗组：第1、3、5天DDP溶液（20 mg DDP溶于200 ml生理盐水）1 ml（含DDP 0.1 mg）腹腔注射。肺岩宁方组：中药0.4 ml（含生药0.8 g）灌胃21 d。综合治疗组：第1、3和5天DDP溶液1 ml腹腔注射，中药0.4 ml（含生药0.8 g）灌胃21 d。停药后次日，处死裸鼠，剥取瘤块，称质量后切取部分肿瘤组织，置于10%中性福尔马林液中固定，48 h内常规石蜡包埋。取余下标本－70 ℃冻存，用于检测。
1.2.2 观察指标
1.2.2.1 抑瘤率
抑瘤率=（空白对照组平均瘤质量－实验组平均瘤质量）/空白对照组平均瘤质量×100%。
1.2.2.2 RT?PCR检测肿瘤组织中HIF?1α mRNA表达
采用TRIzol一步法提取总RNA，在RT反应体系中按照试剂盒说明进行逆转录反应，PCR扩增参照试剂盒说明，引物由上海生物化工有限公司合成。内参照磷酸甘油醛脱氢酶( glyceraldehyde phosphate dehydrogenase, GAP?DH)上游引物：5’?ACA GCC GCA TCT TCT TGT GCA GTG?3’；下游引物：3’?GGC CTT GAC TGT GCC GTT GAA TTT?5’。扩增片段长度174 bp。HIF?1α上游引物：5’?ACA AGT CAC CAC AGG ACA G?3’；下游引物：3’?AGG GAG AAA ATC AAG TCG?5’。扩增片段长度168 bp。反应条件为：GAPDH，94 ℃变性，52.2 ℃退火，72 ℃延伸，25个循环；HIF?1α，94 ℃变性，49 ℃退火，72 ℃延伸，34个循环。在紫外光凝胶成像分析系统下摄片，检测扩增片段灰值，以HIF?1α基因片段与GAPDH片段灰度值的比值作为其相对表达水平数值。
1.2.2.3 免疫组化法检测HIF?1α和p?Akt蛋白表达
免疫组化法检测各组肿瘤组织中HIF?1α和p?Akt蛋白表达，操作步骤参照试剂盒说明书进行。图像分析采用CMIAS多功能真彩色图像分析系统。每张切片随机采样测量4处，计算单位面积下阳性染色区域面积。
1.3 统计学方法
采用SPSS 10.0统计软件进行数据分析。计量资料实验数据用x±s表示。以方差分析检验各组均数间的差异性，组间比较使用最小显著差异（LSD）法。若方差不齐时改用Games?Howell校正检验。P<0.05视为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 对荷瘤裸鼠的体内抑瘤作用
DDP组和综合组的抑瘤率均>50%，两者的平均瘤质量与模型组比较，差异有统计学意义（P<0.01），综合治疗组的抑瘤率大于化疗组的抑瘤率，但两者之间的平均瘤质量比较，差异无统计学意义（P>0.05）。肺岩宁方组的抑瘤率为34.17%，平均瘤质量与模型组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。表1 各组荷瘤裸鼠瘤质量及抑瘤率（略）
2.2 各组肿瘤组织中HIF?1α mRNA表达
综合治疗组HIF?1α mRNA表达低于模型组，两者比较差异有统计学意义（P<0.05），但肺岩宁方组、化疗组与模型组HIF?1α mRNA表达差异无统计学意义。见表2和图1。表2 各组荷瘤裸鼠肿瘤组织HIF?1α mRNA的表达（略）
2.3 HIF?1α和p?Akt蛋白表达
DDP组、肺岩宁方组和综合治疗组HIF?1α蛋白表达低于模型组(P<0.01)，综合治疗组的表达最低。肺岩宁方组和综合治疗组p?Akt表达均显著低于模型组（P<0.05）。见表3和图2、3。表3 各组荷瘤裸鼠肿瘤组织中HIF?1α和p?Akt蛋白表达（略）
3 讨 论
对人类肿瘤标本的免疫组化分析显示，在大多肿瘤组织中HIF?1α呈过度表达，HIF?1α的表达与肿瘤细胞的增殖、浸润及转移能力相关，其高表达常提示不良的预后［2, 3］。在缺氧应激反应中，HIF?1α是信号传递过程中极为重要的因子，调控的靶基因涉及细胞的生长、糖代谢、氧的转运和利用等多个方面。PI3K/Akt是近年发现的信号传递因子。Akt使HIF?1α转录活性增强是通过使细胞内可利用的蛋白池量增加来实现的［4］。蛋白水平下降将导致HIF?1α DNA结合能力下降，且对其下游目的基因的调控能力下降。而PI3K/Akt通路表达增强或对Akt负性调控基因PTEN阻断后，在多种细胞类型中，HIF?1α蛋白水平、DNA结合或转录活性均有增加［5］。抑制HIF?lα的表达已经成为肿瘤治疗的新思路，作为新的抗肿瘤靶点正在进行药物研制开发。
从肺癌诊断分期来看，大多数患者一经发现就为中晚期。中晚期肺癌患者，素体本虚，脏腑失调，邪毒盘踞，加之“久病及肾”，损耗肾中精气，导致肾阴阳失调。故晚期肺癌多见动则气喘，腰酸膝软，食欲不振，舌淡苔少，脉沉细无力等，属精气亏虚，癌毒蕴结。因此，精气亏虚是肺癌发生、的重要内在因素。据此，徐振晔教授提出了以益气养精为主治疗晚期非小细胞肺癌的学术观点，抓住肺癌患者本虚标实的病机，益气养精为主，兼以解毒抗癌，达到治病求本、标本兼顾的目的。肺岩宁方中生黄芪为补气要药，药理研究证明其能提高免疫系统功能，具有抑癌作用，与补气健脾之白术合用，共补肺脾肾之虚；黄精补肾益精，滋补肺脾，与女贞子二药合用，滋肾养阴，补益肺肝脾之阴虚；仙灵脾补肾壮阳，山萸肉补精助阳，二药与黄精、女贞子并用，寓“阴中求阳”、“阳中求阴”之义；石见穿、七叶一枝花、蜂房攻毒消肿，散结抗癌。诸药合用，共奏益气养精、解毒散结之效。临床研究表明肺岩宁方能够稳定晚期肺癌瘤体，抑制肿瘤侵袭和转移，提高患者的生存质量，延长生存期，在抗肺癌转移方面确有良好疗效［6, 7］。
本研究通过肺岩宁方治疗A549荷瘤裸鼠，结果提示，化疗组和综合治疗组的抑瘤率均大于50%，两者的平均瘤质量与模型组比较差异有统计学意义（P<0.01）。肺岩宁方组的抑瘤率为34.17%，平均瘤质量低于模型组（P<0.05）。说明肺岩宁方具有一定的抑制肿瘤生长的作用，肺岩宁方和顺铂在抑制肿瘤生长方面有协同作用。RT?PCR和免疫组化实验表明，肺岩宁方并没有明显抑制HIF?1α mRNA表达的作用，但可以显著减少HIF?1α蛋白的表达。同时也观察到肺岩宁方可以下调p?Akt蛋白的表达。由此提示肺岩宁方对HIF?1α蛋白表达的抑制作用可能与下调p?Akt蛋白表达有关，从而影响下游基因的表达，达到控制肿瘤生长的目的。
恶性肿瘤的靶向治疗已经成为研究热点，目前认为以HIF?1α为选择性治疗靶点是可行的。但中药对HIF?1α信号途径的作用研究尚不多见，本研究为进一步研究肺岩宁方抑制血管生成的有效成分提供了线索。此外，由于中药的组成比较复杂，其抗肿瘤作用是多靶点和多通道的，对于该方的作用机制仍然值得进一步研究。
【】
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