咳喘落口服液对哮喘模型小鼠肺组织中嗜酸性粒细胞凋亡及调控因素的影响
【摘要】 观察咳喘落口服液对哮喘小鼠嗜酸性粒细胞（eosinophil, EOS）凋亡及调控因素的影响，旨在进一步阐明咳喘落抑制气道炎症的机制。方法：56只BALB/c小鼠分为正常组、模型组、咳喘落组和西药(强的松龙)组。除正常对照组外，其余各组小鼠用卵白蛋白和硫酸铝钾致敏激发BALB/c小鼠，复制哮喘模型。在不同时相（末次激发后0 h，第3、7和14天）分别采用改良的Giemsa染色法检测各组小鼠肺组织中EOS数量；免疫组化结合图像分析方法检测各组小鼠肺组织中Fas、Fas配体（Fas ligand, FasL）和Bcl?XL表达的情况；采用TdT介导的带生物素dUTP缺口末端标记技术（terminal deoxynucleotidyl transferase?mediated biotin?dUTP nick end labeling, TUNEL）检测EOS凋亡率。结果：末次激发后第3、7和14天，哮喘模型组小鼠气道炎症明显，以末次激发后第3天最为严重，而咳喘落组、西药组各时相气道组织炎症均明显减轻，EOS数量低于模型组（P<0.05）。咳喘落组末次激发后第3天，其肺组织内FasL、EOS Fas阳性面积和凋亡率较模型组升高，差异有统计学意义（P<0.01），且凋亡率达顶峰，而Bcl?XL的阳性面积及EOS数量低于模型组，差异有统计学意义（P<0.05）；末次激发后第7和14天，中药组EOS中Fas阳性面积和Bcl?XL的阳性面积较模型组明显下降（P<0.01）；且第14天，其肺组织中FasL表达和EOS凋亡率均明显下降（P<0.01）。西药阳性对照组的作用与中药组类似。结论：哮喘小鼠存在以EOS浸润为主的气道炎症，同时伴有凋亡受抑和凋亡延迟。咳喘落可以提高炎症早期肺组织EOS凋亡率，可能是通过减少EOS，提高FasL、Fas表达和降低Bcl?XL表达实现的。
【关键词】 支气管哮喘; 复方; 肺嗜酸性粒细胞增多; 细胞凋亡; Fas配体; Fas; Bcl?XL; 小鼠
Objective: To explore the mechanism of Kechuanluo oral liquid, a compound Chinese herbal medicine, in inhibiting allergic airway inflammation by observing the effects of Kechuanluo on eosinophil (EOS) apoptosis and its regulation factors in asthmatic mice.Methods: Fifty?six BALB/c mice were randomly divided into normal control group (n=16), untreated group (n=16), Western medicine group (n=12) and Kechuanluo group (n=12). Except for the mice in normal control group, asthma was induced in BALB/c mice by using ovalbumin (OVA) and potassium aluminium sulfate. The mice were intragastrically administered with normal saline, Kechuanluo (30 ml/kg daily) and prednisolone tablets (10 mg/kg daily) respectively for two weeks. At 0 hour, the 3rd, 7th and 14th day after the end of OVA sensitization, the EOSs of lung tissues were counted by improved?Giemsa staining method; immunohistochemical method and image analysis were used to detect the expressions of Fas, FasL and Bcl?XL in the EOSs in the four groups; and apoptotic rates of the EOSs in the lung tissues of asthmatic mice were detected by terminal deoxynucleotidyl transferase?mediated biotin?dUTP nick end labeling (TUNEL) technique.Results: Compared with the untreated group, airway inflammations of the mice in the Kechualuo group and Western medicine group were lessened and the EOS counts decreased on the 3rd, 7th and 14th day after the last OVA sensitization (P<0.05). On the 3rd day, the EOSs apoptotic rates, the expression areas of Fas in the EOSs and FasL in the lung tissues were significantly higher in the Kechuanluo group than those in the untreated group (P<0.01), furthermore, the EOS apoptotic rate reached the peak level. Inversely, the EOS count and the expression area of Bcl?XL in the EOSs were obviously lower in the Kechuanluo group (P<0.05). On the 7th and 14th day, the expression areas of Fas and Bcl?XL in the EOSs were significantly decreased in the Kechuanluo group (P<0.01), and on the 14th day, the EOS apoptotic rate and the expression area of FasL in the lung tissues were obviously lower either. The effects exhibited in the Western medicine group were similar to those in the Kechuanluo group.Conclusion: There is airway inflammation with eosinophilic infiltration in asthmatic mice, accompanied with suppressed apoptosis and delayed apoptosis. Kechuanluo can induce and accelerate EOS apoptosis in early inflammation by inhibiting eosinophilic inflammation, improving Fas expression in EOSs and FasL expression in the lung tissues, and reducing Bcl?XL expression in EOSs.
Keywords: bronchial asthma; compounds (TCD); pulmonary eosinophilia; apoptosis; FasL; Fas; Bcl?XL; mice
支气管哮喘是一种以肥大细胞反应、嗜酸性粒细胞（eosinophil, EOS）和T细胞浸润为主，伴有淋巴细胞、巨噬细胞等参与调节的气道慢性炎症性疾病。龙华呼吸内科运用中药合剂——咳喘落口服液治疗支气管哮喘，经两批临床研究（共273例）观察，取得了显效率40%～52%和有效率85%～90%的较满意结果［1, 2］。研究发现细胞凋亡是消除EOS浸润为主的气道炎症的一条途径［3］。然而体内EOS凋亡过程及中药对其影响在国内尚未见报道。本课题在前期研究成果的基础上，动态观察了咳喘落口服液对哮喘小鼠EOS凋亡及调控因素的影响，旨在进一步阐明咳喘落抑制气道炎症的机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 动物
选用BALB/c小鼠，雌性，清洁级，体质量为20～25 g，共56只，由上海中医药大学动物实验中心提供。动物合格证号为0023975，许可证号为SCXK(沪)2003?0002。
1.1.2 药物和试剂
咳喘落口服液由麻黄、制附子、细辛、虎耳草、黄芩和桃仁等按一定比例组成，药物由上海中医药大学龙华医院提供，生药含量1.45 g/ml；强的松龙片，5 mg/片，上海信谊药业有限公司产品；卵白蛋白，上海伯奥生物科技公司产品；鼠抗人Bcl?XL单克隆抗体，北京中山生物技术有限公司产品；兔抗鼠FasL多克隆抗体，Oncogene公司产品；兔抗人Fas多克隆抗体，美国Santa Cruz公司产品；原位细胞凋亡检测试剂盒，德国Boehringer Mannheim公司产品；硫酸铝钾，上海化学试剂有限公司产品，生产批号为020203。
1.2 实验方法
1.2.1 模型分组与处理
56只BALB/c小鼠随机分为正常对照组、模型组、西药对照组和咳喘落组。正常对照组和模型组各16只，西药对照组和咳喘落组各12只。除正常对照组外，根据国外报道[4］的方法略加改动，用卵白蛋白致敏激发BALB/c小鼠，复制哮喘模型。3组小鼠于第1天和第14天予腹腔注射卵白蛋白硫酸铝钾混合液（每毫升含500 μg卵白蛋白和100 mg硫酸铝钾）0.2 ml致敏。第14天鼻内滴入卵白蛋白0.05 ml（100 μg），第25、26和27天鼻内滴入卵白蛋白0.05 ml（50 μg），鼻内滴入前均予腹腔注射0.4%戊巴比妥钠（40 mg/kg）。正常对照组用等量生理盐水替代卵白蛋白和硫酸铝钾进行腹腔注射及鼻内滴入。第27至40天，正常对照组和模型组均胃饲生理盐水，咳喘落组灌胃咳喘落口服液30 ml/(kg·d)，西药对照组灌胃强的松龙片10 mg/(kg·d)。于末次激发后当天（第27天），对照组和模型组分别随机处理4只，末次激发后第3（第30天）、7（第34天）和14天（第41天），各组分别随机处理4只，收集左上肺组织标本待测。
1.2.2 组织学及光镜观察
肺组织用10%甲醛固定，石蜡包埋，切片，HE染色，光镜下观察并拍照。
1.2.3 肺组织中EOS测定
应用改良的Giemsa染色法［5］，EOS核呈蓝色，颗粒呈红色。测定前先用细胞计数板上的刻度对系统进行定标，随机选取内径0.1～0.2 mm的细支气管作为测定对象，通过显微镜×400倍摄取图像，胞浆内颗粒呈红色为阳性细胞。每张切片随机取3个视野，取其均值为阳性细胞数，即EOS计数。
1.2.4 肺组织中EOS凋亡检测
采用末端脱氧核苷酸转移酶介导的带生物素dUTP切口末端标记技术（terminal deoxynucleotidyl transferase?mediated biotin?dUTP nick end labeling, TUNEL）检测凋亡细胞，以细胞核有明显棕黄色为阳性细胞。每一标本连续切片[5］，每张切片选取与计数EOS相同的3个视野，通过显微镜×400倍摄取图像，通过图像分析，结合改良的Giemsa染色法，计数TUNEL阳性EOS数，并EOS凋亡率。EOS凋亡率＝（TUNEL阳性EOS数/EOS总数）×100％。取其均值为该切片EOS凋亡率。
1.2.5 Fas、Bcl?XL和Fas配体检测
采用免疫组化法，按照试剂说明书的流程进行检测。在光镜下观察，以胞浆内棕黄色细颗粒为Fas、Bcl?XL和Fas配体（Fas ligand, FasL）阳性染色。EOS的Fas表达检测：每一标本连续切片，每张切片选取与计数EOS相同的3个视野，通过显微镜×400倍摄取图像，输入图像分析系统内，对图像进行灰度变换，使染色阳性区域与背景明显分开，选择并自动计算EOS表达Fas的阳性面积，取其均值。EOS的Bcl?XL表达检测方法同Fas的检测。肺组织FasL的表达检测：测定前先用血细胞计数板上的刻度对系统进行定标，随机选取内径0.1～0.2 mm的细支气管作为测定对象，通过显微镜×400倍摄取图像，输入图像分析系统内，对图像进行灰度变换，使染色阳性区域与背景明显分开，选择并自动测量阳性面积，每张切片随机取3个视野，取其均值。
1.3 统计学方法
以SPSS 11.0软件进行统计学分析，数据采用x±s表示，进行单因素方差分析、单因素协方差分析、相关分析和偏相关分析。
2 结 果
2.1 小鼠肺组织形态学观察
光镜下显示末次激发后第3、7、14天，哮喘模型组小鼠气道炎症均明显，而以末次激发后第3天最为严重。在细小支气管管壁和伴行动脉周围有大量的炎性细胞浸润，包括淋巴细胞、巨噬细胞和嗜酸性粒细胞，其中以嗜酸性粒细胞为主。而咳喘落组和西药组各时相气道组织炎症均明显减轻。
2.2 肺组织中EOS数量
各时相哮喘模型组小鼠肺组织中EOS数量均高于正常组（P＜0.01）。除正常组外，各组均于末次激发后第3天EOS数量达高峰（P<0.05）；咳喘落和西药组肺组织中EOS数量较模型组低，差别有统计学意义（P<0.05）。同样，末次激发后第7和14天，与模型组相比，咳喘落组和西药组肺组织中EOS数量也明显降低（P＜0.01）。咳喘落与西药组两组间于各时相比较，肺组织中EOS数量差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。表1 不同时间各组小鼠肺组织中EOS数量（略）
2.3 肺组织中EOS凋亡率
各时相哮喘模型组小鼠肺组织中EOS凋亡率均高于正常组（P＜0.01）。于末次激发后第7天模型组肺组织中EOS凋亡率达高峰（P<0.05）；而咳喘落组和西药组小鼠肺组织中EOS凋亡率均于末次激发后第3天达高峰（P<0.05）。末次激发后第3天，两组EOS凋亡率高于模型组，差异有统计学意义（P＜0.01）；末次激发后第7天，两治疗组与模型组EOS凋亡率相似（P＞0.05）；但末次激发后第14天，与模型组相比，咳喘落组和西药组肺组织EOS凋亡率均降低，差异有统计学意义（P＜0.01）。咳喘落组与西药组于各时相比较，小鼠肺组织EOS凋亡率差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表2。表2 不同时间各组小鼠肺组织中EOS凋亡率（略）
2.4 肺组织中EOS表达Fas的阳性面积
末次激发后0 h和第3天，模型组小鼠肺组织EOS表达Fas的阳性面积与正常组比较差异无统计学意义（P>0.05）；但末次激发后第7和14天，模型组小鼠肺组织EOS Fas表达均高于正常组（P<0.05, P<0.01）。模型组于末次激发后第7天Fas表达达高峰（P<0.05），而咳喘落组和西药组均于末次激发后第3天达高峰（P<0.05）。末次激发后第3天，与模型组相比，两治疗组表达Fas阳性面积增多，差异有统计学意义（P<0.01）；两治疗组组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。末次激发后第7和14天，咳喘落组和西药组Fas阳性面积均低于模型组（P<0.01），两治疗组组间比较差异亦无统计学意义（P＞0.05）。见表3。表3 不同时间各组小鼠肺组织中EOS表达Fas的阳性面积（略）
2.5 肺组织中FasL表达
各时相模型组小鼠肺组织中FasL表达的阳性面积均显著高于正常组（P＜0.01）。模型组小鼠肺组织中FasL表达的阳性面积于末次激发后第7天达高峰（P<0.05），咳喘落组和西药组均于末次激发后第3天达高峰（P<0.05）。末次激发后第3天，两治疗组肺组织FasL表达均高于模型组，差异有统计学意义（P<0.01）。末次激发后第7天，与模型组相比，咳喘落组和西药组FasL表达与模型组相似，差异无统计学意义（P>0.05）；末次激发后第14天，模型组小鼠肺组织中FasL表达显著高于咳喘落组和西药组（P<0.01），两治疗组与正常组比较无差异（P>0.05）。治疗组组间于各时相均无明显差异（P>0.05）。见表4。表4 不同时间各组小鼠肺组织表达FasL的阳性面积（略）
2.6 肺组织中EOS Bcl?XL表达
各时相哮喘模型组小鼠肺组织中EOS表达Bcl?XL的阳性面积显著高于正常组（P<0.01）。除正常组外，各组均于末次激发后第3天出现高峰（P<0.05）。末次激发后第3、7和14天，与模型组相比，咳喘落组和西药组肺组织EOS表达Bcl?XL的阳性面积下降（P<0.01）；咳喘落组与西药组于各时相比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表5。表5 不同时间各组小鼠肺组织中EOS表达Bcl?XL的阳性面积（略）
2.7 EOS凋亡率与各因素的相关性分析
控制影响因素EOS数，偏相关分析结果显示：哮喘小鼠EOS凋亡率与其Fas表达呈正相关（r=0.912 4, P<0.01）；与其Fas/Bcl?XL比值呈正相关（r=0.730 7, P<0.01）；而与其Bcl?XL表达无相关性（r=0.412 8, P>0.05）。相关分析结果显示，哮喘小鼠EOS凋亡率与FasL表达呈正相关（r=0.866, P<0.01）。
3 讨 论
一般认为支气管哮喘多责之于寒、痰、热和风邪为患导致肺之宣降失调发生咳、痰、喘。哮喘发病的病机实质是寒，如《医学实在易》曰：“一发则肺俞之寒气，与肺膜之浊痰，狼狈相依，窒塞关隘。”《勉斋医话》中云：“哮证有感冷而发者，有感热而发者，以余验之，感冷而发者居多，盖肺喜温而恶寒。”而其病理因素是痰和瘀。张仲景认为是“膈上病痰”；朱丹溪明确提出“哮喘专主于痰”；唐容川在《血证论》中说：“盖人身气道，不可阻泄……内有瘀血，气道阻塞，不得升降而喘。”
目前普遍认为EOS是引起气道炎症的关键细胞，而EOS凋亡受抑或凋亡延迟是导致气道炎症和持续的重要因素[6］。一般认为致喘动物炎症反应一个周期为7～14 d。我们的研究再次发现哮喘存在以EOS浸润为特征的气道炎症，EOS存在凋亡现象，但出现凋亡受抑和凋亡延迟。推测可能是由于局部凋亡?抗凋亡机制失衡所致，其机制可能与下列因素有关：（1）诱导凋亡因子如Fas及FasL、白细胞介素10（interleukin?10, IL?10）、干扰素γ（interferon?gama, IFN?γ）表达低下，而抑制凋亡因子如Bcl?2、IL?5、IL?3、粒细胞?巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte?macrophage colony?stimulating factor, GM?CSF）、IL?13、一氧化氮（nitric oxide, NO）表达过强；（2）肺组织中低密度EOS比例增加；（3）其他因素，包括支气管上皮细胞和肥大细胞等自分泌GM?CSF，EOS自分泌NO。本研究结果提示，咳喘落口服液能够上调炎症早期肺组织内EOS凋亡率，减轻以EOS浸润为主的气道炎症，具有激素样抗炎作用。这可能是咳喘落口服液治疗哮喘的主要途径之一。
Fas抗原是一个参与细胞凋亡的重要凋亡信号传导分子，研究发现EOS亦能持续表达低水平的Fas蛋白［7, 8］。FasL也属于一种膜蛋白，以可溶性形式和膜结合形式存在。Fas与其单克隆抗体或FasL结合可诱导EOS凋亡，Fas诱导EOS凋亡呈剂量和时间依赖方式［9］。本实验得出炎症早期EOS表达Fas相对低下，这可能是EOS凋亡受抑和凋亡延迟的主要原因之一。我们还发现EOS凋亡率与FasL和Fas表达水平呈正相关，从相关分析结果来看，EOS的Fas表达水平与EOS凋亡率呈同步变化，但其幅度并非完全吻合，表明Fas是诱导EOS凋亡的重要分子，而哮喘小鼠EOS表达功能性Fas受体。但亦不排除部分EOS表达非功能性Fas受体的可能。再者胞内信号转导通路蛋白质酪氨酸磷酸化水平也是决定Fas是否介导EOS凋亡的关键［10］。此外Fas诱导EOS凋亡还受到其他因素的影响，如IFN?γ、肿瘤坏死因子?α（tumour necrosis factor?alpha, TNF?α）可上调EOS Fas的表达而增加其敏感性；而IL?3、IL?5或GM?CSF可抑制此作用［11］；NO也可阻断Fas受体介导的EOS凋亡［12］。本研究结果提示，咳喘落口服液通过促进炎症早期EOS Fas表达及肺组织FasL表达，并使两者有效地结合诱导EOS凋亡，这可能是咳喘落口服液增强炎症早期EOS凋亡的主要原因之一。
在Bcl?2基因家族中，Bcl?2和Bcl?XL具有促进细胞生长，抑制凋亡的作用，而Bax和Bcl?XS具有促进细胞凋亡的作用［13］。本实验结果显示哮喘小鼠肺组织EOS表达Bcl?XL过强，尤其是在炎症早期，这可能是早期EOS凋亡不足或凋亡受抑的另一主要原因。我们还发现EOS凋亡率与EOS表达Bcl?XL的阳性面积无相关性，而与Fas/Bcl?XL比例有良好的相关关系。提示这两个因素中，以Fas介导的EOS凋亡占主导地位，而Bcl?XL在炎症全过程中虽不足以阻止EOS凋亡这一主导地位的形成，但在一定程度上，发挥抑制EOS凋亡效应而致凋亡不足、凋亡受抑和凋亡延迟，尤其在炎症早期高峰相，从而加重炎症反应的强度，延长炎症过程。结果提示，咳喘落口服液可能通过抑制肺组织EOS表达Bcl?XL，阻止EOS凋亡的能力下降，从而增加早期的EOS凋亡，减轻气道炎症强度，缩短炎症过程。
中药制剂对哮喘小鼠嗜酸性粒细胞凋亡的研究目前尚未见报道。本实验研究以临床验证有效的中药合剂咳喘落口服液为研究对象，提示咳喘落口服液可能通过上调肺组织FasL及EOS Fas表达，下调EOS的Bcl?XL表达，从而诱导和促进肺组织内EOS凋亡（主要在炎症早期），减少肺组织中EOS数量，进而抑制气道炎症。
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