Megsin基因E1?5’UTR区A267G与免疫球蛋白A型肾病阴虚证的相关性
作者：钟逸斐, 陈以平, 邓跃毅, 陈楠, 王朝晖
【摘要】 目的：观察增生为主的原发性免疫球蛋白A型肾病（immunoglobulin A nephropathy, IgAN）患者阴虚证（气阴两虚证、肝肾阴虚证）与megsin基因E1?5’UTR区A267G的相关性，寻找原发性IgAN中医证型微观辨证可能的物质基础。
方法：筛选符合标准的原发性IgAN患者120例，进行megsin基因E1?5’UTR区A267G的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）测序，观察中医证型与SNP的相关性。
结果：120例患者中GG型83例，GA型34例，AA型3例。肝肾阴虚证在AA与GA型IgAN患者中所占比例较高，气阴两虚在GG型中所占比例较高（P<0.01）；GG型与GA型＋AA型比数比（odds ratio, OR）为9.800，95%可信区间（confidence interval, CI）为3.969～24.199。这样的差异同样存在于不同性别和不同年龄之间。
结论：Megsin基因E1?5’UTR区A267G可能是区分原发性IgAN肝肾阴虚证和气阴两虚证的物质基础之一。
【关键词】 免疫球蛋白A型肾病; 多态性, 单核苷酸; 基因, megsin
Objective: To observe the correlation between traditional Chinese medicine (TCM) syndromes ("deficiency of qi and yin" and "deficiency of liver yin and kidney yin") and A267G in 5'?untranslated region within exonal of megsin gene, and to search the substantial genetic basis for micro?differentiation of TCM syndromes in primary immunoglobulin A nephropathy (IgAN).
Methods: A total of 120 IgAN cases meeting the diagnostic criteria were enrolled. The sequence of single nucleotide polymorphism (SNP) of A267G in 5'?untranslated region within exonal of megsin gene was tested. The correlation between SNP and TCM syndromes was observed.
Results: There were 83 cases carrying GG genotype, 34 cases carrying GA genotype and 3 cases carrying AA genotype in 120 cases of primary IgAN. There was a high proportion of "deficiency of liver yin and kidney yin" in IgAN cases with AA and GA genotypes, and a high proportion of "deficiency of qi and yin" in IgAN cases with GG genotype (P<0.01). Odds ratio in TCM syndrome distribution between GG genotype and GA plus AA genotype was 9.800, and 95% confidence interval was 3.969?24.199. The discrepancy also resided in IgAN patients with different genders and ages.
Conclusion: A267G in 5'?untranslated region within exonal of the megsin gene may be one of the substantial genetic basis for differentiating "deficiency of liver yin and kidney yin" syndrome and "deficiency of qi and yin" syndrome in primary IgAN.
Keywords: immunoglobulin A nephropathy; polymorphism, single nucleotide; gene, megsin
免疫球蛋白A型肾病（immunoglobulin A nephropathy, IgAN）是世界范围内最常见的原发性肾小球疾病，我国的患病率为20%～47%［1，2］。医学的以激素和免疫抑制剂为主，在取得一定疗效的同时不可避免地带来较大的副作用。中医药对本病的治疗具有一定的疗效，且副作用相对较小，已受到广大医师的关注与青睐。然而由于中医辨证施治受个人经验的制约，证型客观化研究一直是中医界致力于解决的一个瓶颈问题。以往的研究发现，原发性IgAN患者中阴虚体质和阴虚证（气阴两虚证、肝肾阴虚证）占很大比例，且与系膜区增生相关［3］。由于基因与患者的体质与表现的证型有很多的切合点，因此本研究试图从基因单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）入手，研究区分IgAN阴虚证中气阴两虚证与肝肾阴虚证的微观物质基础。本文所选择研究的SNP即megsin基因E1?5’UTR区A267G，上海瑞金已证实其在IgAN患者与正常人群中的表达具有差异性［4，5］，且megsin与IgAN系膜区增生密切相关［6］。本文则在此基础上比较此SNP在肝肾阴虚证与气阴两虚证之间的差异性。
1 资料与方法
1.1 临床资料 2005～2006年就诊于上海中医药大学龙华医院肾内科门诊或病房的原发性IgAN患者120例，其中男性54例，女性66例。年龄（36.29±10.51）岁，其中男性（36.14±10.41）岁，女性（36.40±10.66）岁。血肌酐（87.12±30.75）μmol/L，其中男性（99.68±32.74）μmol/L，女性（77.66±25.57）μmol/L。尿素氮（5.69±1.90）mmol/L，其中男性（5.91±1.88）mmol/L，女性（5.53±1.92）mmol/L。24 h尿蛋白定量（1.47±0.80）g，其中男性（1.43±0.82）g，女性（1.50±0.79）g。诊断标准：经肾活检结合临床表现诊断为原发性IgAN［7］。
1.2 纳入标准 （1）签署知情同意书；（2）经肾活检确诊为IgAN；（3）年龄18～65岁，性别、民族不限；（4）肾脏病理为Haas氏Ⅱ～Ⅳ级；（5）中医证型属于气阴两虚证或肝肾阴虚证；（6）新发病患者（发现即行肾活检明确诊断）且未经任何治疗。
1.3 排除标准 继发性IgAN，或伴新月体肾炎和小血管炎的患者。
1.4 观察方法
1.4.1 证型 根据临床症状进行中医辨证，参照《中药新药治疗慢性肾小球肾炎的临床研究指导原则》（2002年）。
1.4.2 检测方法 采用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）产物直接测序法对外周血megsin基因E1?5’UTR区A267G进行测序。
1.4.3 主要试剂和仪器 PCR扩增系统（大连TaKaRa公司）：rTaqTM酶系统；BIG dye teminator V3.1测序试剂盒（美国ABI Biosystem公司）；DNA Marker DL 2000（大连TaKaRa公司，目录号D501A）；GenElute TM Blood Genomic DNA Kit（美国Sigma公司，NA2010）；ABI 373xl自动测序仪（美国ABI Biosystem公司）。
1.5 实验方法
1.5.1 外周血白细胞DNA的制备（层析法） 按GenElute TM Blood Genomic DNA Kit说明书步骤操作。
1.5.2 候选基因SNP的PCR引物设计及合成 设计对应于该基因第一个外显子上游120 bp至下游220 bp区域序列的引物对，引物长度为19～24 bp，G或C碱基含量在40％～60％之间，变性温度55～60 ℃，末端碱基以G或C为主，最终待测序片断长度一般小于1 200 bp，以保证双向全长测序。设计的PCR引物需作为测序引物，引物应避免多聚体。引物为SERPINB 7f（5'?CAACCACCTTAGTCAGATAC?3'）和SERPINB 7r（5'?AAGCACATTTGTGTATGGTG?3'）。
1.5.3 PCR反应 采用TaKaRa TaqTM PCR系统，以各样本的总DNA为模板，使用引物对SERPINB 7f/SERPINB 7r进行PCR，扩增出megsin基因的第一个外显子区域的双链DNA片段。
1.5.4 DNA片段的纯化和序列测定 对于PCR的产物，使用单向引物SERPINB 7f，用ABI 3730自动测序系统（Applied Biosystems）进行序列测定。
1.5.5 序列的比较分析 将这些序列靠近测序引物处的质量较低的部分去掉；根据测序获得的波形图（trace files），对每条序列进行仔细检查，对测序仪中读错的碱基加以修正；将测得的序列和数据库中已有正常人的该基因的序列放在一起，使用Clustal X（1.81）软件进行多重序列比较。找出具有一定发生频率的SNP位点，根据SNP的位置，查看每条序列的波形图，确定每个样本在该SNP处的基因型，并分类、汇总和统计。
1.6 统计学方法 对分类资料采用卡方检验及分层卡方检验，组间比较采用比数比（odds ratio, OR）分析，统计软件使用SPSS 11.5。
2 结果
2.1 Megsin基因E1?5’UTR区A267G测序结果 本研究对120例患者进行了megsin基因E1?5’UTR区A267G位点的测序，结果显示，GG型83例，GA型34例，AA型3例。其中PCR扩增见图1，megsin基因测序波形图见图2。
图1 不同患者的650 bp PCR扩增产物（略）
Figure 1 650 bp PCR production in different patients
A 650 bp fragment was detected in nine IgAN patients' DNA. The DNA ladder sizes were shown on the left.
图2 Megsin基因测序的波形图（反向）（略）
Figure 2 The sequence wave of megsin gene (Reverse)
A: GG genotype; B: AA genotype; C: GA genotype.
2.2 Megsin基因E1?5’UTR区A267G位点与阴虚证的相关性 120例增生为主的原发性IgAN患者中气阴两虚证72例，肝肾阴虚证48例。经卡方检验，肝肾阴虚证和气阴两虚证在megsin基因E1?5’UTR区A267G不同SNP表型中分布的差异有统计学意义（P<0.01）。见表1。然后，进一步进行OR值的比较。由于已有研究证实megsin基因E1?5’UTR区A267G中GA和AA基因型是IgAN病情加重的危险因素之一［3］，故将GA型与AA型合并。以GG型作为对照，得出肝肾阴虚证中出现GA型或AA型的概率是GG型的9.800倍［OR=9.800，95％可信区（confidence interval, CI）3.969～24.199］。由此得出GG型与GA型加AA型在原发性IgAN阴虚证（气阴两虚证、肝肾阴虚证）患者间分布的差异有统计学意义，即GA型加AA型更易出现在肝肾阴虚证中，而GG型更易出现在气阴两虚证中。
表1 不同中医证型间megsin基因E1?5’UTR区3个SNP的分布差异（略）
Table 1 Distribution differences of polymorphism of A267G in 5'?untranslated region within exonal of megsin gene in different traditional Chinese medicine syndromes
2.3 不同性别之间的分布差异 考虑到不同性别可能会对统计结果产生一定的影响，故进一步进行了不同性别之间的分层卡方检验。男性与女性中GA、AA、GG基因型在中医证型分布的差异均有统计学意义（P<0.01）。见表2。进一步进行OR值计算的比较。以GG型作为对照，将GA型与AA型合并，得出男性肝肾阴虚证中出现GA型或AA型的概率是GG型的8.400倍（OR=8.400，95％CI 2.194～32.155）；女性肝肾阴虚证中出现GA型或AA型的概率是GG型的11.200倍（OR=11.200，95％CI 3.288～38.152）。故由此得出不同性别间GG型与GA加AA型在原发性IgAN阴虚证（气阴两虚证、肝肾阴虚证）患者间的分布差异均具有统计学意义。
2.4 不同年龄层次之间的分布差异 为排除不同年龄层次对于结果的干扰，进行了同一年龄层次的分层卡方检验。不同年龄分层中GA、AA、GG基因型在中医证型的分布差异均有统计学意义（P<0.01）。见表3。进一步进行OR值计算的比较。以GG组作为对照，将GA型与AA型合并，得出<35岁患者肝肾阴虚证中出现GA型或AA型的概率是GG型的8.267倍（OR=8.267，95％CI 2.298～29.741）；≥35岁患者肝肾阴虚证中出现GA型或AA型的概率是GG型的11.636倍（OR=11.636，95％CI 3.196～42.365）。故由此得出不同年龄分层间GG型与GA加AA型在原发性IgAN阴虚证（气阴两虚证、肝肾阴虚证）患者间的分布差异均具有统计学意义。
表2 不同性别患者不同中医证型间megsin基因E1?5’UTR区3个SNP的分布差异（略）
Table 2 Distribution differences of polymorphism of A267G in 5’?untranslated region within exonal of megsin gene in traditional Chinese medicine syndromes of different sexes
表3 不同年龄患者不同中医证型间megsin基因E1?5’UTR区3个SNP的分布差异（略）
Table 3 Distribution differences of polymorphism of A267G in 5'?untranslated region within exonal of megsin gene in traditional Chinese medicine syndromes of different ages
3 讨论
中医证候是病邪对机体的影响及机体对病邪的反映这两者之间相互作用后产生的一种病理状态。不同的个体患同一种疾病时，所表现的证具有个体差异性，而且同一患者在患病的不同阶段所表现的证也是不同的。考虑到疾病至后期影响证候的因素颇多，故本次研究侧重于疾病早期阶段，即不同个体在患IgAN时，最初所表现出来的证型差异的内在因素。证不仅与致病因素的性质、强弱有关，也与患者个体的体质因素有关。体质是中医证型的物质基础之一，又与遗传因素密切相关。而疾病最初所表现出的证型往往与患者的体质最为相关。基因组学认为基因表达的差异及基因序列的多态性决定了个体的差异。由于基因的研究忽略了器官组织的解剖定位，强调的是生物化学的某一环节的改变和疾病过程的内在联系，所以基因与中医体质、证型有很多的切合点［8］。本研究初步探讨megsin基因E1?5’UTR区A267G位点与IgAN患者疾病最初的阴虚证的相关性。
本研究选择megsin基因，首先是由于megsin基因的编码产物megsin特异性地沉积于系膜区，研究表明其与IgA系膜区增生密切相关［5］，是IgAN的重要候选基因之一。其次，本实验选择了气阴两虚证和肝肾阴虚证为研究对象，以往多中心、随机对照试验的研究结果提示这两个证型在肾脏病理中主要对应于增生型［3］。
Megsin基因E1?5’UTR区A267G是该基因的一个SNP，此SNP的不同表型将会影响megsin蛋白水平的表达量。上海市瑞金的研究已证实megsin基因E1?5’UTR区A267G中GA和AA基因型是IgAN病情加重的危险因素之一，即GA和AA基因型能较GG基因型引起更多的蛋白质水平的表达［4，5］。
本实验在瑞金医院已证实megsin基因E1?5’UTR区A267G中GA和AA基因型是IgAN病情加重的危险因素之一的基础上，首先发现megsin基因E1?5’UTR区A267G中GG型在气阴两虚证中所占的比例较高，而AA型与GA型在肝肾阴虚证中所占的比例较高。这样的结果提示megsin基因E1?5’UTR区A267G可能可以作为区分原发性IgAN气阴两虚证和肝肾阴虚证的物质基础之一。在进一步对不同性别（男、女）和不同年龄（<35岁、≥35岁）患者阴虚证与megsin基因E1?5’UTR区A267G相关性研究中得出了相同的结论。因此，本研究对提高IgAN阴虚证的辨证准确率有一定的意义。
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