高糖诱导人肾间质成纤维细胞c?met的表达及黄芪对其的调节作用
【摘要】 目的：体外研究高糖对人肾脏间质成纤维细胞c?met表达的影响，并观察黄芪药物血清对其的调节作用。
方法：体外培养人肾脏间质成纤维细胞，按培养液不同分为正常对照组、高糖组和甘露醇组。于作用后6、12、24、48和96 h，采用逆转录?聚合酶链反应方法检测c?met 和转化生长因子β1（transforming growth factor?beta1, TGF?β1）mRNA表达，蛋白印迹分析检测c?met蛋白的表达。制备含药血清，将成纤维细胞分高糖组、对照血清组和10%黄芪含药血清组，作用24 h和48 h后，检测c?met蛋白和mRNA表达情况。
结果：与正常对照组比较，高糖组细胞培养12 h时c?met mRNA表达增加（P<0.05），24 h达高峰（P<0.01），之后表达逐渐下降；高糖组细胞培养24 h时，TGF?β1的表达开始增加（P<0.05），96 h达到高峰（P<0.01）。与高糖组以及对照血清组比较，黄芪含药血清可使细胞c?met mRNA和蛋白表达增加（P<0.01, P<0.05）。
结论：高糖刺激早期诱导c?met表达，之后表达下降。黄芪可以通过诱导c?met表达延缓糖尿病肾病的进展。
【关键词】 原癌基因蛋白质c?met; 糖尿病肾病; 黄芪; 成纤维细胞; 转化生长因子β1
Methods: A cell culture system of human kidney fibroblasts was developed in vitro. The human kidney fibroblasts were divided into normal control group, high glucose group and mannitol group. Expressions of c?met and transforming growth factor?beta1 (TGF?β1) mRNAs were detected by reverse transcription polymerase chain reaction (RT?PCR) and the expressions of c?met protein were analyzed by Western blot method after 6?, 12?, 24?, 48? and 96?hour culture. The human kidney fibroblasts were also cultured with 10 % Radix Astragali containing serum; the expressions of c?met mRNA and protein were detected after 24? and 48?hour culture.
Results: Compared with the normal control group, expression of c?met mRNA in the high glucose group was significantly increased after 12?hour culture (P<0.05), arriving at the peak after 24?hour culture (P<0.01). The level of TGF?β1 mRNA was higher in the high glucose group than that in the normal control group after 24?hour culture (P<0.05), arriving at the peak after 96?hour culture (P<0.01). Forty?eight hours after treating with 10% Radix Astragali containing serum, the levels of c?met mRNA and protein in fibroblasts were increased, and were higher than those in the high glucose group (P<0.01, P<0.05).
Conclusion: High glucose can induce the expressions of c?met mRNA and protein in earlier period, and then inhibit the expressions. Radix Astragali can up?regulate the expressions of c?met mRNA and protein of human kidney fibroblasts, which may be one of its action mechanisms in delaying the progression of diabetic nephropathy.
Keywords: proto?oncogene protein c?met; diabetic nephropathy; Radix Astragali; fibroblasts; transforming growth factor?beta1
原癌基因c?met是具有酪氨酸激酶活性的受体，与其相结合的配体是肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor, HGF）。有研究表明，c?met在器官发育的早期起着重要作用［1］，并可以介导HGF的所有反应。研究发现糖尿病大鼠肾脏髓质有c?met表达［2］，提示c?met与糖尿病肾病（diabetic nephropathy, DN）存在相关性。然而c?met参与DN发病的具体机制国内外尚未见有报道。因此本研究以DN主要靶细胞——肾脏间质成纤维细胞为研究对象，探讨c?met在肾间质细胞中活性的改变，及黄芪对其表达的影响，为临床寻求理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要药品和试剂 TRIzol（Gibco公司）、莫洛尼氏鼠白血病病毒（Moloney?murine leukemia virus, M?MLV）逆转录酶（reverse transcriptase, RT）（Gibco公司）、Taq DNA聚合酶（Promega公司）和羊抗人c?met多克隆抗体（R&D公司）。黄芪注射液（上海福达制药有限公司，2 ml/支，含黄芪皂苷成分4 mg，相当于生药4 g）、甘露醇（Sigma公司，生产批号为M?4125）和葡萄糖（Fisher Scientific公司，生产批号为053037）。
1.2 实验方法
1.2.1 含药血清制备 选体质量200 g雄性SD大鼠2只，灌胃前禁食12 h，1只予黄芪注射液［按黄芪皂苷2.4 mg/(kg·d)］灌胃制备含药血清，给药剂量相当于50 kg成人用量10倍。1只以等量生理盐水灌胃制备对照血清。采用2次加强给药的方式，首次给药2 h后，再予相同剂量黄芪注射液灌胃。第2次给药后3 h下腔静脉采血。静置，分离血清，56 ℃灭活30 min。－70℃冰箱冷藏备用。
1.2.2 人肾脏间质成纤维细胞的培养与处理 人肾脏组织来源于行肾肿瘤切除的正常肾脏组织，经典的消化培养法［3］进行体外原代培养，用SP试剂盒免疫组化方法鉴定。取第3代和第4代细胞用于实验。实验前24 h将培养液换成无血清培养液培养，使细胞处于静止期。将细胞分为3组。正常对照组：培养液中葡萄糖终浓度为5.5 mmol/L；高糖组：培养液中葡萄糖终浓度为25 mmol/L；甘露醇组：培养液中葡萄糖终浓度为5.5 mmol/L，甘露醇终浓度为20 mmol/L。另外，用药组分为2组。高糖+对照血清组：25 mmol/L葡萄糖培养液加入对照血清，对照血清终浓度为10%；高糖+黄芪含药血清组：25 mmol/L葡萄糖培养液加入黄芪含药血清，黄芪含药血清终浓度为10%，与高糖组作为对照。每组同时设6个复孔。
1.2.3 c?met和转化生长因子β1 mRNA表达的检测 取对数生长期的成纤维细胞以2×105/ml密度转种于25 cm2的细胞培养瓶中，同步化后，按照上述分组刺激细胞，分别于培养2、12、24、48和96 h用半定量逆转录聚合酶链式反应（reverse transcription polymerase chain reaction，RT?PCR）检测c?met和转化生长因子β1（transforming growth factor beta1, TGF?β1） mRNA表达。提取总RNA。取RNA 2 μg进行逆转录反应，逆转录成cDNA。等量cDNA以50 μl反应体系，进行体外PCR扩增。c?met引物序列报道［4］，上游引物5’?TCT TGG GAC ATC AGA GGG TC?3’；下游引物5’?TGA CTG CAG GAC TGG AAA TG?3’。扩增产物长度为222 bp。TGF?β1引物序列（由Primer3软件设计）上游引物5’?TCT GAA TTC ATG GCC TGG ACA CCA ACT A?3’；下游引物5’?TCT GTC GAC ACC TCA GCT GCA CTT GCA GGA?3’。扩增产物长度为363 bp。以甘油醛?3?磷酸脱氢酶（glyceraldehyde?3?phosphate dehydrogenase, GAPDH）为内参照，该引物扩增产物长度为626 bp。胶片经光密度扫描，并以GAPDH光密度值进行标准校正，进行半定量分析。
1.2.4 c?met蛋白表达的检测 蛋白印迹法检测肾间质成纤维细胞c?met蛋白表达，细胞蛋白质用TRIzol提取。在样品中加入1 ml TRIzol，加入200 μl氯仿静置10 min，12 000×g离心15 min，吸去上清后在中间相和有机相中加300 μl无水乙醇混匀，2 000×g离心5 min。吸取上清加异丙醇，放置10 min后12 000×g离心10 min，弃去上清后加入0.3 mol/L盐酸胍，95%乙醇洗涤3次，7 500×g离心5 min。之后加2 ml乙醇混匀，7 500×g离心5 min。沉淀抽干，加1%SDS?聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamide gel, PAG）上样缓冲液50 ℃水浴10 min，10 000×g离心10 min，收集上清。测定蛋白质浓度，之后每样本分别取30 μg蛋白质，于100 ℃变性3 min后，用7% SDS?PAG进行电泳。电泳结束后用Bio?Rad公司的半干式电转移仪，将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene difluoride, PVDF）滤膜上，封闭1 h，漂洗，加入山羊抗人c?met抗体（1 μg/ml），于4 ℃孵育16 h后与兔抗山羊二抗（1∶100稀释）37 ℃孵育30 min，于漂洗后室温下二氨基联苯胺显色，蒸馏水洗涤。应用Swart View图像分析系统测其灰度值，以正常对照组表达量的均值为100%，计算各组c?met蛋白表达量。
1.3 统计学方法 计量资料数据均以x±s表示，使用SAS 8.0统计软件对数据进行t检验。P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 高糖环境成纤维细胞c?met mRNA表达 半定量RT?PCR显示，与正常对照组比较，高糖组作用成纤维细胞12 h后c?met mRNA表达上升，且在24 h达到高峰，差异有统计学意义（P<0.05）；但作用48 h时，c?met mRNA表达量下降，与24 h相比表达量降低了49.5%，并且在96 h时表达量更低。与高糖等渗的甘露醇只有在作用24 h可以出现c?met mRNA表达量的升高，与正常对照组比较差异有统计学意义（P<0.01），此时仍低于高糖组c?met mRNA表达量，差异有统计学意义（P<0.05）。在其他培养时间段中，甘露醇组c?metmRNA表达水平与正常对照组相似，未表现出诱导c?met mRNA表达的现象。见图1和表1。
2.2 高糖环境成纤维细胞c?met蛋白表达 蛋白印迹结果提示，与RT?PCR结果相似，c?met mRNA表达升高时间点，c?met蛋白表达也同样升高。与正常对照组相比，高糖组成纤维细胞作用12 h时c?met蛋白（分子量190 kD）表达量增加（P<0.05），24 h时达到峰值（P<0.01）。然而随着高糖刺激时间延长，c?met蛋白表达量也逐渐减少，96 h时与正常对照组比较，差异无统计学意义。各时间点甘露醇组成纤维细胞c?met蛋白表达量与正常对照组相似，并且作用后12、24和48 h c?met蛋白表达量低于高糖组，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。见表2和图2。
图1 不同组别作用24 h后c?met mRNA的表达（略）
Figure 1 Expression of c?met mRNA after 24?hour culture in different groups
1: Normal control group; 2: High glucose group; 3: Mannitol group.
表1 高糖对成纤维细胞c?met mRNA表达的影响（略）
Table 1 Effect of high glucose on expression of c?met mRNA
*P<0.05, **P<0.01, vs normal control group; △P<0.05, vs high glucose group.
表2 高糖对成纤维细胞c?met蛋白表达的影响（略）
Table 2 Effect of high glucose on expression of c?met protein
*P<0.05, **P<0.01, vs normal control group; △P<0.05, △△P<0.01, vs high glucose group.
图2 不同组别作用24 h后c?met 蛋白表达（略）
Figure 2 Expression of c?met protein after 24?hour culture in different groups
1: Normal control group; 2: High glucose group; 3: Mannitol group.
2.3 高糖环境成纤维细胞TGF?β1 mRNA表达 高糖环境同样诱导成纤维细胞TGF?β1 mRNA表达升高，与正常对照组比较，其表达量增加2倍。高糖组成纤维细胞TGF?β1 mRNA表达水平的升高在高糖诱导24 h出现，并且存在持续、稳定表达升高，一直持续并且到第96 h达到高峰。与高糖等渗甘露醇组同样出现TGF?β mRNA表达增加，作用24 h和48h时与正常对照组比较，差异有统计学意义（P<0.05），但仍低于高糖组（P<0.05）。诱导96 h时甘露醇组细胞TGF?β mRNA表达与正常对照组比较，差异无统计学意义。TGF?β mRNA与c?met mRNA表达存在时间上的差异。见表3。
2.4 黄芪含药血清对成纤维细胞c?met蛋白和mRNA表达的影响 经RT?PCR反应分析得出，对照血清组成纤维细胞c?met mRNA表达与高糖组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。经黄芪药物血清处理过的细胞，作用48 h后，成纤维细胞c?met mRNA表达比对照血清组显著升高（P<0.05），升高了75.3%。蛋白印迹分析证实，黄芪含药血清同样可以诱导c?met蛋白表达，与对照血清组比较升高了70%（P<0.05）。图3、4和表4。
表3 高糖对成纤维细胞TGF?β1 mRNA表达的影响（略）
Table 3 Effect of high glucose on expression of TGF?β1 mRNA
*P<0.05, **P<0.01, vs normal control group; △P<0.05, △△P<0.01, vs high glucose group.
图3 含黄芪血清作用48 h c?met mRNA的表达（略）
Figure 3 Expression of c?met mRNA after treating with 10% Radix Astragali serum for 48 hours
1: High glucose group; 2: 10% control serum group; 3: 10% Radix Astragali serum group.
图4 黄芪含药血清作用48 h c?met 蛋白的表达（略）
Figure 4 Expression of c?met protein after treating with 10% Radix Astragali serum for 48 hours
1: High glucose group; 2: 10% control serum group; 3: 10% Radix Astragali serum group.
表4 黄芪对肾间质成纤维细胞c?met蛋白和c?met mRNA表达的影响（略）
Table 4 Expressions of c?met protein and mRNA in the fibroblasts treating with 10% Radix Astragali serum
△P<0.05, △△P<0.01, vs high glucose group; ▲P<0.05, vs 10% control serum group.
3 讨论
在DN发生和过程中，肾小管间质的损害普遍存在，并与肾功能恶化密切相关。人们已经认识到肾间质对肾组织实质和血管成分给以结构支撑，同时肾间质和肾血管之间所有的交换都需要通过间质的分隔空间。另外肾间质细胞对细胞外基质产生影响［5］。因此体外培养人肾间质成纤维细胞将为成纤维细胞各种生物学特性、肾间质纤维化的发病机制、药物对肾间质的干预作用等项研究提供良好的实验工具。本研究以肾间质成纤维细胞为研究对象，观察高糖对肾间质的主要构建细胞——成纤维细胞的影响，模拟体内糖尿病肾病环境，旨在观察高糖长期作用于肾间质而产生的变化。
c?met是HGF的受体。研究发现，HGF是一种多效性的生长因子，具有重要的抗纤维化作用。同时在调节肾脏代偿性生长、肾小管损伤修复功能和肾脏再生等生理、病理过程中起重要作用［6］。外源性加入HGF可以缓解急性肾功能衰竭，加速肾脏的再生［7］。HGF对终末期肾衰所致的肾小球硬化及肾小管间质纤维化有预防作用［8］。我们以往的研究也证实［9?11］，高糖环境下诱导的TGF?β表达，可以被外源性HGF抑制，从而起到抗肾脏纤维化作用。HGF的作用主要是通过其特异性受体c?met来完成的。局部c?met的表达将为HGF提供受体结合位点，c?met的胞外部分是配体HGF的结合域。HGF与c?met结合后，受体胞浆内酪氨酸激酶被激活，发生自身磷酸化，HGF才可以发挥多种效应。本研究中，高糖作用成纤维细胞早期，有c?met mRNA以及蛋白表达上调，作用后期c?met表达量显著降低。说明c?met在DN早期调节中起作用。然而与高糖等渗的甘露醇同样可以诱导c?met mRNA表达，说明高糖早期诱导c?met mRNA表达可能部分是由于受到渗透压作用的关系。研究同时得出，TGF?β1 mRNA与c?met mRNA表达在时间效应上存在差异。高糖作用早期以c?met mRNA表达为主，TGF?β1 mRNA表达量升高不明显。随着c?met mRNA表达量逐渐下降，TGF?β1 mRNA表达开始上升，并占主导地位。因此分析认为，高糖这个有害信号刺激机体后，诱导机体产生一过性防御反应，早期c?met mRNA快速升高，启动HGF/c?met系统，促进细胞有丝分裂，对高糖损伤的细胞进行修复。如果高糖环境持续作用，则c?met mRNA表达逐渐下降，机体防御反应能力下降，随着TGF?β1 mRNA表达升高，细胞发生肥大，细胞外基质成分合成增多，导致肾脏进行性损伤。
由此可知，如果能够诱导c?met表达，将可能启动HGF/c?met系统发挥作用，为HGF提供有效的结合位点，发挥抑制TGF?β表达等作用，从而抑制细胞肥大，延缓慢性纤维化过程。我们以往研究证实，中药黄芪具有降低蛋白尿，并可抑制肾脏肥大，降低TGF?β表达的功效［12］。本研究应用血清药的原理，比较接近药物体内环境中产生药理效应的真实过程。采用2 h连续灌胃2次，多次给药可使血清药物浓度出现累加效应，提高血清药物的浓度。同时经过灭活处理，避免血清中其他成分对细胞产生毒性作用，对体外实验造成干扰，因此方法可靠。
黄芪含药血清作用高糖诱导的肾脏成纤维细胞，发现黄芪对高糖环境下的肾脏成纤维细胞c?met蛋白和mRNA表达具有诱导增加作用。黄芪药物血清刺激24 h时对c?met蛋白和mRNA表达的影响并不十分显著，作用48 h时黄芪对该系统的作用才显著升高，可以在基因水平和蛋白质水平上调c?met系统表达。说明黄芪发挥作用需要有时间效应。这也进一步说明，中药需要长期刺激才能充分发挥作用。由此认为，黄芪可以通过诱导c?met表达升高，使得HGF更加有效地发挥其抗纤维化作用，从而可能通过该途径达到延缓糖尿病肾病进展的目的。因此，本研究为黄芪临床提供了理论基础，为黄芪延缓慢性肾脏病进展得出了更加有力的依据。
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