地灵丹汤对单侧输尿管梗阻大鼠模型肾间质纤维化的防治作用
作者：宦红娣, 张景红, 郑士荣, 孟巍巍, 张军力
【摘要】 目的：研究中药复方地灵丹汤对单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）致肾间质纤维化模型大鼠肾间质纤维化的防治作用及其可能机制。
方法：将60只SD大鼠随机分为假手术组、模型组、依那普利组及地灵丹组。采用UUO法建立肾间质纤维化大鼠模型，观察血尿素氮、血清肌酐和24 h尿蛋白定量及肾组织病理改变，并采用免疫组织化学法检测转化生长因子β1（transforming growth factor?β1, TGF?β1）、α?平滑肌肌动蛋白（α?smooth muscle actin, α?SMA）、纤维连接蛋白（fibronectin, FN）及层黏连蛋白（laminin, LN）的表达。
结果：第7天模型组肾间质大量炎症细胞浸润及胶原表达，TGF?β1、FN和LN表达面积百分率较假手术组明显增加（P<0.05）；地灵丹组间质纤维化面积较模型组减少（P<0.05）。第14天地灵丹组和依那普利组肾间质TGF?β1、α?SMA、FN和LN表达面积百分率较模型组减少（P<0.05），BUN、SCr和24 h尿蛋白无明显差异。第21天地灵丹组SCr、肾间质纤维化和TGF?β1表达面积百分率较依那普利组和模型组下降（P<0.05）。
结论：地灵丹能减轻单侧输尿管梗阻模型大鼠的蛋白尿和肾间质纤维化，抑制TGF?β1、α?SMA、FN和LN的表达。在较长时间应用后，地灵丹对模型大鼠的肾功能保护作用优于依那普利。
【关键词】 地灵丹; 肾间质纤维化; 转化生长因子β1; α?平滑肌肌动蛋白; 纤维连接蛋白; 层黏连蛋白; 大鼠
Objective: To investigate the preventive and therapeutic effects and the possible mechanisms of Dilingdan Decoction (DLDD), a compound Chinese herbal medicine, on rats with renal tubulointerstitial fibrosis induced by unilateral ureteral obstruction (UUO).
Methods: Sixty SD rats were randomly divided into sham?operated group, untreated group, enalapril?treated group and DLDD?treated group. Blood urea nitrogen (BUN), serum creatinine (SCr), urine protein quantization in 24 hours and pathological changes of the obstructed kidney were observed. The expressions of transforming growth factor?β1 (TGF?β1), alpha?smooth muscle actin (α?SMA), fibronectin (FN) and laminin (LN) were detected by immunohistochemical method and colored?multimedia pathological image analysis system.
Results: Massive inflammatory infiltrates and collagen expression in renal interstitial in the untreated group were observed on the 7th day. Compared with the sham?operated group, percentages of area of TGF?β1, α?SMA, FN and LN expressions in the untreated group were markedly increased (P<0.05), while the percentage of area of interstitial fibrosis was decreased in the DLDD?treated group as compared with the untreated group (P<0.05). On the 14th day, the percentages of area of TGF?β1, α?SMA, FN and LN expressions were declined in two treated groups as compared with the untreated group (P<0.05), but had no statistical difference in biochemical indicators, including BUN, SCr and 24?hour urinary protein. On the 21st day, the level of SCr and the percentage of area of TGF?β1 expression in the DLDD?treated group were lower than those of the enalapril?treated group (P<0.05).
Conclusion: DLDD can reduce the excretion of urinary protein and the degree of interstitial fibrosis, and significantly inhibit the expressions of TGF?β1, α?SMA, FN and LN. DLDD is superior to enalapril in protecting renal function after long?time application in rats.
Keywords: Dilingdan Decoction; renal interstitial fibrosis; transforming growth factor?beta1; alpha?smooth muscle actin; fibronectin; laminin; rats
肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis, RIF）是各种原发或继发性肾脏疾病持续导致肾功能不可逆损害的病理过程，其主要的病理特征为肾间质纤维细胞的增生和细胞外基质如Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ型胶原，纤维连接蛋白（fibronectin, FN），层黏连蛋白（laminin, LN）的过度积聚。它是各种肾脏疾病发展到慢性肾功能衰竭的共同途径，其中转化生长因子β1（transforming growth factor?β1, TGF?β1）被公认为是最主要的致纤维化因子［1, 2］。国内外学者对肾间质纤维化的研究日益重视。有研究证实血管紧张素转换酶抑制剂（angiotensin?converting enzyme inhibitor, ACEI）类药物具有一定的抗纤维化作用，但临床效应尚不理想。本研究基于数十年的临床观察和分析，经反复筛选，以生地黄、丹参和仙灵脾等组成的中药复方地灵丹汤（Dilingdan Decoction, DLDD），采用动物实验，观察地灵丹汤对肾间质纤维化的保护作用，探讨其在肾间质纤维化防治中的价值。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 主要试剂与仪器 兔抗大鼠肾组织TGF?β1多克隆抗体、兔抗大鼠肾组织α?平滑肌肌动蛋白（alpha?smooth muscle actin, α?SMA）多克隆抗体、兔抗大鼠肾组织FN多克隆抗体、兔抗大鼠肾组织LN多克隆抗体、即用型SABC试剂盒、二氨基联苯胺（diaminobenzidine, DAB）显色剂、生物素化山羊抗小鼠IgG抗体（以上试剂均购自武汉博士德公司）、Masson染色试剂盒（上海虹桥乐翔医用试剂技术有限公司）。图像分析仪、BX51系统显微镜（OLYMPUS公司）、分析软件（Image?pro Plus version 4.1 for Windows）均由上海中医药大学实验中心图像分析室提供。
1.1.2 实验药品 地灵丹汤由人民解放军第八五中药制剂室制备，由生地黄20 g，仙灵脾20 g和丹参15 g组成，按以上处方比例水煎2次，浓缩成1︰1（即含生药1 g/ml）的水溶液，高温高压灭菌，密封，4 ℃冰箱保存备用。马来酸依那普利片，10 mg/片，上海浦东药厂有限公司生产，国药准字H31021938。
1.1.3 实验动物 雄性SD大鼠60只，SPF级，体质量180～220 g，购于上海西普尔?必凯实验动物有限公司，合格证号：SCXK（沪）2003?0002。由上海中医药大学实验动物中心提供并饲养。
1.2 实验方法
1.2.1 模型制作 采用大鼠单侧输尿管结扎（unilateral ureteral obstruction, UUO）法［3］建立肾间质纤维化模型，以2% 戊巴比妥钠（2 ml/kg）腹腔注射麻醉后，开腹结扎左侧输尿管近肾盂段，剪断输尿管，然后逐层缝合。假手术组手术入路方式同UUO组，进入腹腔后分离左输尿管但不结扎输尿管。
1.2.2 实验分组 所有动物在用药期间自由进食和饮水，饲养环境为每笼5只，温度（21±2）℃，湿度（55±2）%。按体质量随机分为4组：假手术组6只、模型组18只、依那普利组18只和地灵丹组18只。地灵丹组和依那普利组分别于手术后24 h给药，地灵丹组以地灵丹煎剂4 ml灌胃（相当于成人剂量50倍），1次/d；依那普利组按10 mg/(kg·d)给药（溶于蒸馏水中配成1 mg/ml溶液），1次/d；假手术组和模型组于术后24 h开始给予生理盐水4 ml灌胃。
1.3 检测指标及方法
1.3.1 肾脏病理检查 随机选取模型组、依那普利组和地灵丹组6只大鼠分别于术后第7、14和21天处死；假手术组中的6只大鼠于术后第7天处死。处死大鼠取肾脏组织予常规石蜡包埋切片、HE染色下观察肾小管及间质病变。肾间质纤维化面积采用Masson染色法，光学显微镜下（×400）随机选取10个不含肾小球和血管的不重叠视野，以肾间质蓝或绿色染色区为阳性目标区，用彩色多媒体病理图像分析系统进行灰度变换后，以阳性区域占该视野面积百分率的平均值表示病变程度。
1.3.2 血尿素氮和肌酐检测 所有大鼠眼眶静脉采血1 ml，Eppendorf管内0～4 ℃冰箱保存，采用HITACHI 7170型全自动生化分析仪检测（中国人民解放军第八五医院生化室）血尿素氮（blood urea nitrogen, BUN）和血清肌酐（serum creatinine, SCr）
1.3.3 24 h尿蛋白定量检测 分别于处死前1天将大鼠置于代谢笼中，收集24 h尿液，双缩脲比色法检测尿蛋白定量。
1.3.4 免疫组织化学检测 肾组织中TGF?β1、α?SMA、FN和LN的表达采用免疫组化方法检测。3 μm厚石蜡切片常规脱腊和水化后，经3％过氧化氢孵育10 min灭活内源性过氧化氢酶，蒸馏水洗3次。进行热抗原修复，将切片浸入0.01 mol/L枸橼酸缓冲液（pH 6.0）中加热至沸腾后断电（间隔5～10 min后重复一次），冷却，用PBS（pH 7.2～7.6）洗涤2次。滴加5％ BSA封闭液，室温20 min。甩去多余液体，不洗。分别滴加兔抗大鼠FN、LN、α?SMA和TGF?β1（1︰100）抗体，4 ℃冰箱过夜。PBS洗涤2 min×3次。滴加生物素化山羊抗小鼠IgG，37 ℃ 20 min。PBS洗2 min×3次。滴加试剂SABC，37 ℃ 20 min。PBS洗5 min×4次。DAB显色，镜下控制反应时间，苏木素轻度复染后脱水、透明和封片。显微镜下（×400）随机选取10个不含肾小球和血管的不重叠视野，以肾间质棕褐色染色区为阳性目标区，用彩色多媒体病理图像分析系统进行灰度变换后，阳性区域占该视野面积百分率，以10个视野的平均值表示纤维化病变程度。
1.4 统计学方法 计量资料数据采用x±s表示，采用SPSS 13.0软件进行统计学分析，采用两因素方差分析及最小显著差异t检验比较组间差异，P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 各组大鼠BUN、SCr和尿蛋白定量 造模后第7天，各组BUN、SCr和尿蛋白定量比较差异无统计学意义。第21天依那普利组和地灵丹组SCr含量与尿蛋白定量均较模型组低（P<0.05），且地灵丹组SCr水平低于依那普利组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。
表1 各组大鼠BUN和SCr以及24 h尿蛋白定量（略）
Table 1 Results of BUN, SCr, and urine protein quantization in 24 hours in different groups
△P<0.05, vs untreated group; ▲P<0.05, vs enalapril?treated group.
2.2 肾脏病理改变 实验第7天假手术组大鼠肾间质组织胶原染色主要位于肾小管基膜、系膜区和肾小管间的毛细血管周围。模型组大鼠肾间质染色表现为肾小管上皮细胞萎缩，肾小管腔扩张，间质炎症细胞和成纤维细胞增生；地灵丹和依那普利药物组也有以上表现，但肾小管上皮细胞萎缩和肾小管腔扩张程度较模型组明显减轻，间质纤维化面积少（P<0.05）。第14天可见肾间质大量炎症细胞浸润，成纤维细胞局灶大量出现，肾小管局灶性萎缩或扩张，间质灶性纤维化。模型组最重，出现了肾小管断裂；依那普利组肾间质纤维化面积较模型组明显减少（P<0.05）。第21天模型组大鼠肾间质大量炎症细胞和成纤维细胞，肾小管大面积萎缩、扩张或塌陷，肾间质大面积纤维化；地灵丹组和依那普利组肾间质纤维化面积百分率较假手术组明显减少（P<0.05），且地灵丹组少于依那普利组（P<0.05）。见表2。
表2 各组大鼠肾间质纤维化面积百分率（略）
Table 2 Percentages of interstitial fibrosis area in rats in different groups
*P<0.05, vs sham?operated group; △P<0.05, vs untreated group; ▲P<0.05, vs enalapril?treated group.
2.3 半定量免疫组织化学检测结果
2.3.1 肾间质TGF?β1和α?SMA的表达 镜下观察各组大鼠肾间质病理切片发现，造模第7天，假手术组大鼠肾间质血管平滑肌和近端肾小管处有少量TGF?β1表达，而模型组大鼠肾间质中，TGF?β1广泛表达于近端肾小管和肾间质细胞。第14和21天，地灵丹组和依那普利组大鼠肾间质TGF?β1表达与模型组比较明显减少（P<0.05），且第21天地灵丹组大鼠肾间质中TGF?β1表达较依那普利组减少（P<0.05）。假手术组大鼠肾间质中，α?SMA仅表达于血管平滑肌和血管外膜层细胞，在肾小管和间质几乎无表达。第14和21天，地灵丹组和依那普利组肾间质α?SMA表达均较模型组显著减少（P<0.05），且第14天地灵丹组肾间质中α?SMA表达较依那普利组减少（P<0.05）。见表3。
2.3.2 肾间质FN和LN的表达 假手术组FN和LN在肾小球及肾小管基底膜呈弱阳性表达，肾间质无阳性着色。模型组FN和LN主要在萎缩的肾小管周围、肾小球及肾小管基底膜。第14和21天，地灵丹组和依那普利组FN和LN表达均较模型组显著减少（P<0.05），但2组间比较无明显差异。见表4。
表3 各组大鼠肾间质TGF?β1和α?SMA表达面积百分率（略）
Table 3 Percentages of area of TGF?β1 and α?SMA expressions in renal interstitium in different groups
*P<0.05, vs sham?operated group; △P<0.05, vs untreated group; ▲P<0.05, vs enalapril?treated group.
表4 各组大鼠肾间质FN和LN表达面积百分率（略）
Table 4 Percentages of area of FN and LN expressions in renal interstitium in different groups
*P<0.05, vs sham?operated group; △P<0.05, vs untreated group.
3 讨论
RIF是各种原因所致肾脏疾病进展至终末期的共同途径和主要病理特征。肾纤维化本虚标实的病机特点已为大多数医家所认可，即肾虚为肾纤维化形成的根本，贯穿于肾纤维化的始终。中医认为其外因多为风、寒、湿和热邪等，内因多为饮食失宜、七情内伤和脏腑受损。其病机主要归于肾脏自身病变日久，或他脏病久累及于肾，认为纤维化的发生属于“肾虚血瘀”，“虚”和“瘀”为肾脏纤维化的基本病机［4, 5］；病性多属本虚标实；病位在肾。治则以补肾活血法为主，临床上采用补肾、滋阴、活血、温阳、益气、行气等治法予以扶正、培本、祛邪。地灵丹以生地黄、丹参、仙灵脾、制大黄和覆盆子等药物组方，具有滋阴温阳、清热化瘀和泄毒固精的作用，切合肾间质纤维化的基本病机。既往研究表明，地灵丹有降低糖尿病肾病患者尿微量白蛋白排泄、降低血糖和抑制肾脏肥大等作用，具有确切的肾脏保护作用［6, 7］。
UUO模型是典型的肾小管间质损伤的动物模型。本研究发现模型组出现了SCr和尿蛋白排泄的升高，并随着造模时间的延长逐渐升高。地灵丹在第21天降低SCr的作用最明显，优于依那普利，对BUN的作用无明显差异，提示地灵丹可以减少蛋白尿、降低SCr，具有一定的肾保护作用。
RIF的机制较为复杂，成纤维细胞在纤维化过程起重要作用。肾脏中的成纤维细胞分为间质成纤维细胞、循环纤维细胞和由上皮细胞转化而来的成纤维细胞、肾髓源性成纤维细胞、表达α?SMA的肌成纤维细胞。间质成纤维细胞是介于肌成纤维细胞和平滑肌细胞之间的终末分化细胞，可产生大量的Ⅰ型和Ⅲ型胶原，表达α?SMA，是间质细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的主要来源。小管上皮细胞向间充质细胞转分化（epithelial?mesenchymal transition，EMT）是导致肾间质纤维化的主要机制之一。TGF?β1是各种因子诱导EMT的中心环节，始动并调节EMT的全过程。在正常肾脏中仅有微量的TGF?β1表达，在各种慢性肾脏疾病中TGF?β1过度表达［8］。肾间质纤维化中TGF?β1的主要作用机制为：（1）促进ECM成分的产生；（2）抑制ECM降解，主要通过抑制降解酶的活性，增强这些抑制酶的活性；（3）增加ECM受体的表达，通过增加整合素的表达，促进ECM与细胞的黏附；（4）促进上皮细胞转分化成肌成纤维细胞［9, 10］。本研究发现，模型组TGF?β1、α?SMA、FN和LN的表达较假手术组明显增多，而地灵丹组、依那普利组TGF?β1、α?SMA、FN和LN均较模型组表达减少。第14天地灵丹组α?SMA表达较依那普利组减少（P<0.05），第21天地灵丹组TGF?β1表达较依那普利组减少（P<0.05），提示地灵丹、依那普利可能通过有效降低TGF?β1的表达从而延缓肾间质纤维化的进展。
地灵丹可以降低SCr和尿蛋白排泄，明显减轻梗阻侧肾脏的炎症浸润，抑制TGF?β1和α?SMA等致纤维化因子，从而减少FN、LN以及胶原的沉积，提示该组方在一定程度上延缓了肾间质纤维化的进展。在较长时间应用后，地灵丹对模型动物的肾功能保护作用优于依那普利，该组方能否在临床上得到广泛的应用尚有待于更大规模的临床试验的验证。
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