蒲黄总黄酮抑制棕榈酸培养下C2C12骨骼肌细胞白细胞介素6的表达
作者：娄少颖, 刘毅, 陈伟华, 应健, 何燕铭, 王文健
【摘要】 目的：观察蒲黄总黄酮（Pollen Typhae total flavones，PTF）对棕榈酸培养下C2C12骨骼肌细胞白细胞介素6（interleukin?6, IL?6）表达的影响，探讨PTF改善骨骼肌胰岛素抵抗（insulin resistance, IR）的可能机制。
方法：0.25 mmol/L棕榈酸培养建立骨骼肌细胞IR模型。根据处理方法不同，设对照组、模型组、核转录因子κB（nuclear factor?kappaB, NF?κB）抑制剂PDTC组、罗格列酮（rosiglitazone, ROS）组、ROS＋PDTC组、PTF组和PTF＋PDTC抑制剂组。处理16 h后，3H?脱氧葡萄糖摄入法观察细胞对葡萄糖的转运率，实时定量多聚酶联反应检测IL?6 mRNA的表达，酶联免疫吸附测定法检测细胞培养上清中IL?6蛋白水平。
结果：0.25 mmol/L棕榈酸培养16 h，C2C12细胞葡萄糖摄取率下降30.43%，IR模型建立；PTF可使IR模型细胞葡萄糖转运率增加32.39%，IL?6 mRNA表达及细胞培养上清液中IL?6蛋白水平均显著下降，差异有统计学意义（P<0.05）；加入PDTC后，细胞IL?6 mRNA表达及细胞培养上清液中IL?6蛋白水平上升（P<0.05）。
结论：PTF通过抑制NF?κB通路而抑制C2C12骨骼肌细胞IL?6 mRNA表达及蛋白分泌，可能是其减轻骨骼肌炎症状态和改善IR的机制之一。
【关键词】 蒲黄总黄酮; 棕榈酸; 胰岛素抵抗; 白细胞介素6; C2C12细胞株
Objective: To observe the effects of Pollen Typhae total flavones (PTF) on expression of interleukin?6 (IL?6) mRNA and protein secretion in C2C12 cell strain of skeletal muscle cells cultured with palmitate, and to explore the mechanism of PTF in relieving insulin resistance (IR).
Methods: The IR of C2C12 cells was induced by co?culturing with palmitate. The C2C12 cells were divided into normal control group, untreated group, PDTC (a nuclear factor?kappaB inhibitor) treated group, rosiglitazone (ROS)?treated group, ROS+ PDTC ?treated group, PTF?treated group and PTF+PDTC?treated group. Sixteen hours after culture, the transportation rate of glucose was observed by 3H?deoxyglucose uptake method; IL?6 mRNA expression in C2C12 cells was assayed by real time polymerase chain reaction (Real?time PCR), and level of IL?6 protein secretion in culture supernatant was detected by enzyme linked immunosorbent assay.
Results: Compared with the normal control group, the transportation rate of glucose of cells in untreated group was decreased 30.43% after 16?hour palmitate culture, and was increased 32.39% in the PTF?treated group. Compared with the untreated group, the levels of IL?6 mRNA expression in cells and IL?6 protein secretion in supernatant were significantly decreased in the PTF?treated group (P<0.05). The levels of IL?6 mRNA expression in cells and IL?6 protein secretion in supernatant were increased in PTF+PDTC?treated group as compared with PFT?treated group (P<0.05).
Conclusion: PTF can inhibit the IL?6 mRNA expression and IL?6 protein secretion via nuclear factor?kappaB pathway in C2C12 skeletal muscle cells, which may be one of its mechanisms in relieving inflammation conditions and insulin resistance in C2C12 skeletal muscle cells.
Keywords: Pollen Typhae total flavones; palmitate; insulin resistance; interleukin?6; C2C12 cell strain
脂质在骨骼肌中蓄积是引起骨骼肌胰岛素抵抗（insulin resistance, IR）的重要原因［1］。近年来越来越多的证据表明炎症与骨骼肌IR关系密切［2］。脂质蓄积导致核转录因子κB（nuclear factor?kappaB, NF?κB）途径被激活，使白细胞介素6（interleukin?6, IL?6）、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor?alpha, TNF?α）和IL?1等相关细胞因子显著增加［3, 4］。中医药在改善炎症状态和骨骼肌IR等方面有较好的疗效。本研究通过观察蒲黄的主要成分——蒲黄总黄酮（Pollen Typhae total flavones, PTF）对棕榈酸诱导的处于IR状态的C2C12骨骼肌细胞IL?6的影响，探讨PTF改善骨骼肌IR的可能机制。
1 材料与方法
1.1 细胞培养和分化 小鼠C2C12骨骼肌细胞株购自美国菌种保藏中心（American Type Culture Collection, ATCC），用含10％小牛血清的高糖达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbecco’s modified Eagle’s medium, DMEM）培养，每3 d传代1次。于90％细胞融合时换用含2％马血清的DMEM进行诱导，2 d换液1次，诱导分化4～7 d，待95％细胞被诱导分化出现肌管时用于实验［5］。
1.2 药物与试剂 PTF由上海信谊药业有限公司提供。棕榈酸、吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC）由Sigma公司提供，罗格列酮（rosiglitazone, ROS，分子量473.52）粉剂由浙江天马制药有限公司提供；IL?6酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）试剂盒由R＆D公司提供；3H?脱氧葡萄糖由北京原子高科有限公司提供；TRIzol试剂由美国Invitrogen公司提供；BIO RAD Icycler 5色荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）仪、Icycler version3.1.7050荧光定量分析软件均由BIO RAD公司提供。
1.3 实验药品配制 PTF的配制：取PTF 16 mg加入2 ml ddH2O中，溶解后配成8 g/L的原液，0.22 μm过滤器抽滤除菌；ROS的配制：取ROS 47.352 mg加入5 ml DMSO中，溶解后配成2×104 μmol/L的原液，0.22 μm过滤器抽滤除菌。－20 ℃储存备用，临用前稀释。
1.4 细胞分组和干预 在6孔或12孔板中培养和分化骨骼肌细胞，待细胞分化成熟之后，分组如下：正常对照组、模型组、模型＋PDTC（5 mmol/L）组、PTF组、PTF＋PDTC组、ROS组和ROS＋PDTC组。正常对照组含1％牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）的DMEM培养，模型组细胞予含0.25 mmol/L棕榈酸和1％ BSA的DMEM培养，在模型组基础上，PTF组加入0.5 g/L PTF，ROS组加入5 μmol/L ROS，PDTC组加入PDTC，PTF＋PDTC组和ROS＋PDTC组分别再加入2种相应药物，干预16 h。16 h后检测葡萄糖转运率，转运率下降率有统计学意义，提示IR模型建立成功［5］，可供实验用。
1.5 葡萄糖摄取实验 IR模型细胞接种于24孔板，以克?林二氏磷酸盐缓冲液（Krebs?Ringer phosphate buffer, KRPB）冲洗3次，再以含1 nmol/L胰岛素的KRPB洗3次，再以含100 nmol/L胰岛素的KRPB 37 ℃孵育30 min； 加入1 ml含0.5 μCi/m1 3H?脱氧葡萄糖，37 ℃孵育20 min，以冰预冷的含10 mmol/L葡萄糖的PBS快速冲洗3次中止反应。加入1 ml 0.1 mol/L氢氧化钠作用2 h，取细胞裂解液，液闪计数其每分钟衰变数［6］。
1.6 实时定量PCR检测IL?6 mRNA表达 （1）各组细胞药物干预16 h，吸去上清，分别收集各组细胞，按照Trizol试剂说明书方法提取细胞总RNA，以紫外分光光度计260 nm和280 nm波长测定RNA吸光度(absorbance, A)，用A260/A280比值确定RNA浓度；然后每个样本取2 μg RNA，在RNA酶抑制剂以及反转录酶(M?MLV)作用下将RNA逆转录为cDNA，－20 ℃保存备用。（2）IL?6 上游引物：5’?CTG CAA GAG ACT TCC ATC CAG TT?3’，解链温度（melting temperature, Tm）58 ℃；下游引物：5’?GAA GTA GGG AAG GCC GTG G?3’， Tm 59 ℃；探针：fam?5’?CCT TCT TGG GAC TGA TGC TGG TGA CA?3’?tamara，Tm 69 ℃。内参甘油醛?3?磷酸脱氢酶（glyceraldehyde?3?phosphate dehydrogenase, GAPDH）上游引物：5’?GAC AAC TTT GGT ATC GTG GAA GG?3’，Tm 60 ℃；下游引物：5’?CCA GTA GAG GCA GGG ATG ATG T?3’， Tm 60 ℃；探针：fam?5’?CTC ATG ACC ACA GTC CAT GCC ATC ACT?3’?tamara，Tm 70 ℃。IL?6扩增长度70 bp，内参GAPDH扩增长度140 bp；IL?6及内参的引物均由上海生物工程技术服务有限公司合成。（3）荧光定量反应体系及反应条件：预混合的PCR反应液（荧光定量Master MIX）27.5 μl，上、下游引物各0.6 μl，探针0.3 μl，模板（100 ng）1 μl。扩增条件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，扩增50个循环。（4）绘制曲线和分析结果：根据各样本的荧光定量PCR扩增曲线图，采用BIO RAD公司的Icycler Version 3.1.7050荧光定量分析软件，分析PCR过程中各检测样本的CT（cycle threshold）值。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表CT值，根据未知样品的CT值，从标准曲线上出该样品的起始拷贝数。
1.7 ELISA检测细胞培养上清中IL?6蛋白浓度 准备好洗涤缓冲液和IL?6标准品，所有样品和标准品做双份重复；将100 μl标准品或样品，加入包被抗体的微孔板合适位置的微孔内；50 μl生物素标记的抗IL?6抗体加入包被抗体的微孔板的微孔内，轻摇板架，混匀，加盖，37 ℃孵育120 min；洗涤微孔板；在每孔内加入100 μl酶结合物，轻敲微孔板，使内容物充分混合，加盖，37 ℃孵育60 min；在第2次孵育结束前15 min之内与底物溶液混合；按照上述方法重复洗板；在每孔内加底物100 μl，加盖，37 ℃下孵育15 min；在每孔内加终止液100 μl，轻敲微孔板，使内容物充分混合；在30 min内，用酶标仪在450 nm处测出光密度（optical density, OD）值。然后根据IL?6标准品的浓度（ng/L）和其在450 nm处的OD值平均值绘制标准曲线。根据各样品的OD值分别计算出相应的样品浓度。
1.8 统计学方法 采用Stata 7.0软件统计包进行数据处理。计量资料数据以x±s表示，组间比较采用ｔ检验，计数资料采用χ２检验。
2 结果
2.1 PTF对IR模型葡萄糖转运的影响 0.25 mmol/L棕榈酸培养骨骼肌细胞16 h，葡萄糖转运率明显下降，为正常对照组的69.57%（P<0.05），根据Reaven等［7］提出的IR经典定义，并［5］，我们认为骨骼肌细胞IR模型建立成功。PTF组C2C12细胞葡萄糖转运率为模型组的132.39%，ROS组葡萄糖转运率为模型组的145.88％，与模型组比较差异均有统计学意义（P<0.05）；PTF组与ROS组细胞葡萄糖转运率比较，差异无统计学意义（P>0.05）。
2.2 IR模型细胞IL?6 mRNA表达 Real?time PCR结果显示，模型组IL?6 mRNA表达明显增强，是正常对照组的3.5倍（P<0.01）；加入NF?κB抑制剂PDTC后，IL?6 mRNA表达比模型组减少（P<0.05）；PTF组和ROS组细胞IL?6 mRNA的表达与模型组比较明显减少（P<0.01）；PTF+PDTC组和ROS+PDTC组细胞IL?6 mRNA表达与单纯PTF和ROS组比较增加，分别是原来的1.30倍和1.42倍（P<0.05），且该两组与模型＋PDTC组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）；PTF组与ROS组之间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见图1。
图1 各组骨骼肌细胞IL?6 mRNA表达（略）
Figure 1 Expression of IL?6 mRNA in C2C12 skeletal muscle cells in different groups
**P<0.01, vs normal control group; △P<0.05, △△P<0.01, vs model group; ▲P<0.05, vs PTF?treated group. □P<0.05, vs ROS?treated group; ■P<0.05, vs model＋PDTC?treated group. PDTC? refers to no PDTC, PDTC+ refers to PDTC added, n=6.
2.3 骨骼肌细胞培养上清中IL?6蛋白含量 与正常对照组比较，模型组细胞培养上清中IL?6蛋白含量明显增加，为（612.58±18.60）ng/L，差异有统计学意义（P<0.01）；模型组加入PDTC后，IL?6蛋白含量为（299.48±11.16）ng/L，比模型组降低（P<0.01)；加入PTF和ROS后，IL?6蛋白含量明显下降，分别为（239.31±10.69）ng/L和（251.27±11.44）ng/L，与模型组比较，差异有统计学意义（P<0.01)；PTF和ROS组在加入PDTC后IL?6蛋白含量升高，分别为（323.08±9.69）ng/L和（351.81±10.47）ng/L，与PTF组和ROS组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。PTF组与ROS组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见图2。
图2 各组骨骼肌细胞培养上清中IL?6蛋白含量（略）
Figure 2 Contents of IL?6 protein in culture supernatant of C2C12 skeletal muscle cells in different groups
**P<0.01, vs normal control group; △△P<0.01, vs model group; ▲P<0.05, vs PTF?treated group; □P<0.05, vs ROS?treated group. PDTC?refers to no PDTC, PDTC+ refers to PDTC added, n=6.
3 讨论
在人体内，短时间的脂质浸润可导致骨骼肌的IR，Jové等［5］观察到骨骼肌IR和NF?κB途径被活化有密切关系。NF?κB是广泛存在于胞浆中的一种转录因子，在静息状态下以p65?p50二聚体的形式存在，与NF?κB抑制物( inhibitor of NF?κB, IκB)结合而呈非活性状态。血浆游离脂肪酸（free fatty acids, FFA）升高导致细胞内脂酰辅酶A和二酰基甘油（diacylglycerol, DAG）增多，二者是蛋白激酶C（protein kinase C, PKC）强有力的激活剂。PKC活性增高使IκB磷酸化，随后降解，从而对NF?κB抑制作用减弱，释放增加，导致促炎症反应和调节促炎症基因的表达，比如IL?6和TNF?α［5, 6, 8］。其中，骨骼肌IR与IL?6的关系最为密切［9］。炎症因子的增多，反过来又会加重IR［5］，因此，改善炎症状态对于改善骨骼肌IR具有重要意义。
国外研究表明，C2C12骨骼肌细胞在0.5 mmol/L棕榈酸培养条件下，通过激活PKC和NF?κB途径使IL?6 mRNA表达明显增强，细胞培养上清中IL?6蛋白水平亦增加；而在加入NF?κB抑制剂PDTC后，IL?6 mRNA的表达和蛋白表达均减少［5］；相似的结果可见于TNF?α［6］。因此推测在棕榈酸培养条件下，促炎症因子表达增加与NF?κB途径被激活有关，而阻断此途径后，能够抑制炎症反应，从而改善骨骼肌IR。
中药蒲黄性味甘平，入肝和心包经，具有活血化瘀和利湿、泄浊等功效，是高脂血症等IR相关疾病的常用中药［10, 11］，其主要成分PTF能够调节糖脂代谢和改善IR等［11］。药理研究证实，PTF具有调节血糖，降低血清胆固醇和甘油三酯等作用［11, 12］。课题组前期研究亦发现，PTF能够改善3T3?L1脂肪细胞对葡萄糖的摄取，提高其储脂能力，减少外周血FFA的浓度，通过调节糖代谢和脂代谢以缓解IR［11］。
本实验中，0.25 mmol/L棕榈酸培养C2C12骨骼肌细胞16 h，IR模型建立，加入PTF后，葡萄糖转运率明显提高；在模型组中，C2C12骨骼肌细胞IL?6 mRNA表达和上清液中蛋白含量均较正常对照组显著增加；加入PTF后，细胞IL?6 mRNA表达和上清液中蛋白水平受到明显抑制，比模型组减少；而在加入PDTC后，细胞IL?6 mRNA和蛋白表达均较PTF组增加。PTF与抑制剂叠加后作用比单纯抑制剂更能明显抑制IL?6 mRNA的表达；PTF组在加入抑制剂后，IL?6 mRNA表达有所增加，但与抑制剂组比较，仍然是偏低的；我们推测，因PDTC是NF?κB的特异性抑制剂，其加入以后，可能部分阻断或掩盖了PTF作用的某些位点，抑或两者有某些交互作用，削弱了中药的作用，因此会出现上述现象。
由此我们推测中药蒲黄可能是通过抑制NF?κB通路，使相应的炎症因子如IL?6 mRNA表达和分泌减少，使葡萄糖转运率增加，从而发挥其减轻炎症状态、调节糖脂代谢和改善骨骼肌IR的作用，其相关机制尚需进一步研究。
【】
1 Hirabara SM, Silveira LR, Abdulkader F, et al. Time?dependent effects of fatty acids on skeletal muscle metabolism. J Cell Physiol. 2007; 210(1): 7?15.
2 de Luca C, Olefsky JM. Inflammation and insulin resistance. FEBS Lett. 2008; 582(1): 97?105.
3 Bruce CR, Dyck DJ. Cytokine regulation of skeletal muscle fatty acid metabolism: effect of interleukin?6 and tumor necrosis factor?alpha. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2004; 287(4): E616?621.
4 Kern PA, Ranganathan S, Li C, et al. Adipose tissue tumor necrosis factor and interleukin?6 expression in human obesity and insulin resistance. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2001; 280(5): E745?751.
5 Jové M, Planavila A, Laguna JC, et al. Palmitate?induced interleukin 6 production is mediated by protein kinase C and nuclear?factor kappaB activation and leads to glucose transporter 4 down?regulation in skeletal muscle cells. Endocrinology. 2005; 146(7): 3087?3095.
6 Jové M, Planavila A, Sánchez RM, et al. Palmitate induces tumor necrosis factor?alpha expression in C2C12 skeletal muscle cells by a mechanism involving protein kinase C and nuclear factor?kappaB activation. Endocrinology. 2006; 147(1): 552?561.
7 Reaven GM, Chen YD. Role of insulin in regulation of lipoprotein metabolism in diabetes. Diabetes Metab Rev. 1988; 4(7): 639?652.
8 Itani SI, Zhou Q, Pories WJ, et al. Involvement of protein kinase C in human skeletal muscle insulin resistance and obesity. Diabetes. 2000; 49(8): 1353?1358.
9 Pradhan AD, Manson JE, Rifai N, et al. C?reactive protein, interleukin 6, and risk of developing type 2 diabetes mellitus. JAMA. 2001; 286(3): 327?334.
10 Yan H, Chen PD, Ding AW. Advancement in research of preparation of Pollen Typhae and its chemical components and pharmacological effect. Jiangsu Zhong Yi Yao. 2005; 26(1): 59?61. Chinese with abstract in English.
严辉, 陈佩东, 丁安伟. 蒲黄的炮制及其化学成分、药理作用的研究进展. 江苏中医药. 2005; 26(1): 59?61.
11 He YM, Wang WJ, Chen WH, et al. Effects of Pollen Typhae total flavone on glucose and lipid metabolism in 3T3?L1 adipocytes. Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao. 2006; 4(6): 593?595. Chinese with abstract in English.
何燕铭, 王文健, 陈伟华, 等. 蒲黄总黄酮对3T3?L1脂肪细胞糖脂代谢的影响. 中西医结合学报. 2006; 4(6): 593?595.
12 Zhu MJ. Clinical observation on effect of Pollen Typhae in treating 60 cases of hyperlipidemia. Jiujiang Yi Xue. 2002; 17(4): 218. Chinese.
朱铭金. 生蒲黄治疗高脂血症60例疗效观察. 九江医学. 2002; 17(4): 218.
