肾阳虚大鼠模型的水通道蛋白1改变
【摘要】 目的：探讨中医学肾阳虚证的物质基础。
方法：运用腺嘌呤灌服和氢化可的松肌肉注射2种方法制备大鼠肾阳虚模型（分别称为模型Ⅰ和模型Ⅱ），100只Wistar大鼠随机分为正常对照组，模型Ⅰ组，模型Ⅱ大、中和小剂量组。造模结束后，常规生化法检测血肌酐（serum creatinine，SCr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、尿肌酐（urine creatinine，UCr）含量，冰点比重法检测尿渗透压（urine osmotic pressure，Uosm）、高岭土法检测尿17?羟皮质类固醇含量。实时逆转录聚合酶链式反应检测肾脏组织中水通道蛋白?1表达。
结果：两种模型大鼠均出现类似肾阳虚证表现。与正常对照组和模型Ⅱ各剂量组比较，模型Ⅰ组大鼠SCr和BUN含量升高（P<0.05），UCr含量和Uosm降低（P<0.05）。模型Ⅰ组大鼠尿17?羟皮质类固醇含量和肾组织AQP?1表达比正常对照组下降（P<0.05）。与正常对照组比较，模型Ⅱ中剂量组SCr含量增加（P<0.05），尿17?羟皮质类固醇含量降低（P<0.05），而模型Ⅱ各剂量组大鼠肾组织AQP?1表达升高（P<0.05），并显示出一定的剂量依赖关系，以高剂量组升高最为明显。
结论：水通道蛋白可能是肾阳虚证的物质基础之一。
【关键词】 肾阳虚; 水通道蛋白; 大鼠
Methods: Two kinds of rat models of deficiency of kidney?yang were induced by adenine intragastric administration (model Ⅰ) and hydrocortisone intramuscular injection (model Ⅱ). One hundred rats were randomly divided into normal control group, model Ⅰ group, low?dose model Ⅱ group, medium?dose model Ⅱ group and high?dose model Ⅱ group. After model establishment, contents of serum creatinine (SCr), blood urea nitrogen (BUN), and urine creatinine (UCr) were detected by automatic biochemistry analyzer; freezing point method was used for 24?hour urinary osmotic pressure (Uosm) testing and kaolinite method was used to detect the content of urinary 17?hydroxycorticosteroid (17?OHCS). Expression of aquaporin?1 in renal tissue was observed by using real time reverse transcription polymerase chain reaction.
Results: The rats of model groups had the characteristics of kidney?yang deficiency syndrome. The contents of SCr and BUN were significantly higher in model Ⅰgroup than in normal control group and three model Ⅱ groups (P<0.05), and UCr and Uosm were significantly lower (P<0.05). The level of urinary 17?OHCS and expression of aquaporin?1 in renal tissue were decreased in the model Ⅰ group (P<0.05) as compared with the normal control group. Compared with the normal control group, the content of SCr was increased and urinary 17?OHCS was decreased in the medium?dose model Ⅱ group, but the expression of aquaporin?1 was increased in three model Ⅱ groups with a dose?dependent manner.
Conclusion: Aquaporin?1 may be one of the material foundations of kidney?yang?deficiency syndrome.
Keywords: deficiency of kidney?yang; aquaporin?1; rats
肾在中医脏腑学说中占有重要地位，“肾为先天之本”和“生命之根”。体内水液的存留、分布与排泄作用，主要是靠肾的气化功能完成的，而气化作用的动力就是肾阳。本实验运用氢化可的松肌肉注射和腺嘌呤灌服两种方法制备大鼠肾阳虚模型[1]，观察2种模型大鼠的肾功能、肾小管功能及水通道蛋白?1的变化，探讨肾阳虚证与水通道蛋白的关系，为中医证型规范化及建立中医疗效评价体系提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验药物和主要试剂 腺嘌呤购自上海新兴化工试剂研究所，分子式C5H5N5，分子量为135.13，批号为061108，含量≥98%；层析试剂，1 g/瓶。注射用氢化可的松琥珀酸钠购自天津市生物化学制药厂，批号为20060202，50 mg/支。焦碳酸二乙脂（diethyl pyrocarbonate, DEPC）由Sigma公司提供，TRIzol、莫洛尼氏鼠白血病病毒（Moloney murine leukemia virus, M?MLV）逆转录酶和Taq酶由美国Invitrogen公司提供，实时聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）检测仪和ABI?7300 Sequence Detection System由美国ABI公司提供。
1.1.2 实验动物 雄性Wistar大鼠100只，清洁级，体质量200～250 g，由上海中医药大学曙光实验动物中心提供，实验动物生产许可证号为SCXK(沪)2003?0003。
1.2 实验方法
1.2.1 造模方法 参照[1]方法建立腺嘌呤致肾阳虚（模型Ⅰ）和氢化可的松致肾阳虚（模型Ⅱ）2种模型，将大鼠编号后根据随机数分为正常对照组，模型Ⅰ组，模型Ⅱ大、中和小剂量组。模型Ⅰ组20只，予2％腺嘌呤（20 mg/ml，生理盐水配制）2 ml灌胃，1次/d，连续4周。模型Ⅱ小剂量组20只，氢化可的松5 mg/(kg·d)，中剂量组20只，氢化可的松20 mg/(kg·d)，大剂量组20只，氢化可的松50 mg/(kg·d)，1次/d，后肢肌肉注射，连续2周。正常组20只中10只予生理盐水2 ml灌胃，1次/d，连续4周；另外10只予生理盐水0.3 ml后肢肌肉注射，1次/d，连续2周。实验过程中所有大鼠自由饮水。
1.2.2 观察指标及检测方法 造模结束后，代谢笼留取24 h尿样，应用冰点渗透压仪检测尿渗透压（urine osmotic pressure, Uosm），应用高岭土法检测尿17?羟皮质类固醇（17?hydroxycorticosteroid，17?OHCS）含量。用2%戊巴比妥钠（2 ml/kg）腹腔注射麻醉大鼠后腹主动脉取全血，在4 ℃条件下，3 000 r/min离心10 min，制备血清，检测各指标。血肌酐（serum creatinine，SCr）、血尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、尿肌酐（urine creatinine，UCr）应用全自动生化分析仪检测。每组抽取5只大鼠，迅速摘取肾脏，分离包膜后液氮中保存，应用实时PCR检测仪检测肾脏组织中水通道蛋白?1（aquaporin?1，AQP?1）表达。经过组织总RNA的抽提，逆转录cDNA，进行PCR扩增。扩增体系如下：SYBRGreen Mix 32.5 μl，上游引物F 0.5 μl，下游引物R 0.5 μl，ddH2O 14.5 μl，cDNA模板2 μl，总体积50 μl。扩增条件：95 ℃ 10 min、95 ℃ 20 s、55 ℃ 30 s和72 ℃ 30 s，40个循环。数据采用ABI Prism 7300 SDS Software熔解曲线分析。引物序列 GAPDH–FP：5’?CGT TGA CAT CCG TAA AGA CC?3’；GAPDH–RP：5’?AAC AGT CCG CCT AGA AGC AC?3’。扩增片段长度328 bp。AQP?1–FP：5’?CGA GGT GAC CTG GGC ACC ATC CAT GAC?3’；AQP?1–RP：5’?CTG CTC CAC CTT GGG CTT GCG ACC CAC?3’。扩增片段长度286 bp。引物由广州达辉公司合成。
1.3 统计学方法 应用SPSS 11.0统计软件进行多样本两两比较的q检验或独立样本非参数检验进行两两比较。
2 结果
2.1 一般情况观察 模型Ⅰ组大鼠造膜14 d后、模型Ⅱ组大鼠造膜10 d后开始出现不同程度的体质量下降、活动减少、反应迟钝、喜扎堆、畏寒喜暖、体毛枯萎和肛周污染的症状，并出现采食量减少和饮水量略增加。类似人的肾阳虚症状[1]。正常对照组大鼠未出现上述症状。
2.2 各组大鼠血清肌酐和尿素氮含量 模型Ⅰ组大鼠SCr和BUN含量较正常对照组大鼠和模型Ⅱ各剂量组大鼠明显升高（P<0.05）。与正常对照组比较，模型Ⅱ中剂量组SCr含量增加，差别有统计学意义（P<0.05），BUN含量差异无统计学意义；模型Ⅱ小和大剂量组大鼠SCr和BUN含量有升高趋势，但差异无统计学意义。见表1。
2.3 各组大鼠UCr含量和Uosm 模型Ⅰ组大鼠UCr含量和Uosm较正常对照组大鼠和模型Ⅱ各剂量组大鼠明显降低（P<0.05）。模型Ⅱ各剂量组大鼠UCr含量和Uosm与正常对照组比较，差异无统计学意义。见表2。
表1 各组大鼠SCr和BUN（略）
Table 1 Contents of SCr and BUN in rats in different groups
*P<0.05, vs normal control group; △P<0.05, vs model Ⅰ group.
表2 各组大鼠UCr和尿17?OHCS含量及24 h Uosm（略）
Table 2 Contents of UCr and urinary 17?OHCS, Uosm of 24?hour urine in rats in different groups
*P<0.05, vs normal control group; △P<0.05, vs model Ⅰ group.
2.4 各组大鼠尿17?OHCS含量 模型Ⅰ组大鼠尿17?OHCS含量较正常组大鼠明显降低（P<0.05），并低于模型Ⅱ低剂量组和高剂量组。模型Ⅱ中剂量组大鼠的尿17?OHCS含量较正常组大鼠降低（P<0.05），而模型Ⅱ大剂量组和小剂量组与正常对照组比较差异无统计学意义。见表2。
2.5 各组大鼠肾组织AQP?1表达 与正常组大鼠比较，模型Ⅰ组大鼠肾组织AQP?1表达量明显下降（P<0.05），而模型Ⅱ各剂量组大鼠肾组织AQP?1表达量升高，并显示出一定的剂量依赖关系，以高剂量组升高最为显著。模型Ⅰ组大鼠肾组织AQP?1表达量低于模型Ⅱ各剂量组（P<0.05）。见表3。
表3 各组大鼠肾组织AQP?1表达（略）
Table 3 Expression of aquaporin?1 in renal tissue of rats in different groups
*P<0.05, vs normal control group; △P<0.05, vs model Ⅰ group.
3 讨论
3.1 水通道蛋白 AQP是生物膜上特异性转运水的整合蛋白质。1988年Denker等[2]首先从哺乳动物的红细胞膜上发现了一个28 kD的疏水性跨膜蛋白，1991年完成了其cDNA克隆，1993年正式命名为水通道蛋白（或称水孔蛋白）。AQP在机体的分布广泛，大多选择性地分布在与体液吸收和分泌有关的上皮细胞及可协同跨细胞转运的内皮细胞中，执行着各部位水分重吸收和液体分泌的功能，对维持细胞、组织、器官及全身的水平衡起着决定性作用。目前研究最多的是泌尿、呼吸和消化等系统的水通道分布。肾脏中AQP?l分布于肾近曲小管和亨氏襻细支降段的管腔侧和基底膜侧，介导近曲小管和亨氏襻降支对水的重吸收。AQP?l对尿液浓缩也起着重要作用，敲除AQP?l基因大鼠不能在脱水状态下浓缩尿液[3, 4]。
3.2 两种肾阳虚动物模型的比较 氢化可的松诱导肾阳虚模型，为目前较为常用的方法，是利用激素的生理效应，使机体呈现烦躁多动等阴虚征象，同时可致下丘脑?垂体?肾上腺皮质轴反馈抑制，潜伏着“阴损及阳”的病理机转[5]。也有观点认为，此类模型与人类“阳虚”有较大距离，是由于长期大量运用氢化可的松导致肾上腺皮质轴功能抑制的结果[6]。腺嘌呤诱导的肾阳虚模型，系腺嘌呤堵塞肾小管管腔引起管腔囊状扩张，肾小管损伤严重，随着病程的进展，肾单位大量丧失，出现“大白肾”，进而出现非常明显的阳虚症状[7, 8]。17?OHCS是目前公认的中医阳虚证的标志性指标，本研究结果提示：腺嘌呤模型组和氢化可的松模型中剂量组大鼠造模后均出现一系列类似中医肾阳虚的症状，且两种模型大鼠尿17?OHCS含量均较正常组大鼠降低，符合肾阳虚证的特征；腺嘌呤模型组大鼠尿17?OHCS含量较氢化可的松低剂量组和高剂量组大鼠明显降低（P<0.05）；与氢化可的松各剂量组大鼠相比，腺嘌呤模型组大鼠SCr和BUN含量明显升高（P<0.05），尿肌酐和尿渗透压明显降低（P<0.05），说明两种肾阳虚模型在肾脏功能影响方面存在差异。是否腺嘌呤模型更符合肾阳虚证动物模型的要求，有待今后进一步研究。
3.3 肾阳虚与AQP?l 中医理论认为，体内津液代谢主要有赖于胃的摄入、脾的运化转输、肺的宣发肃降和肾的蒸腾气化，通过三焦通达全身。代谢后的水液，尿液归于膀胱，汗液通过呼吸道和皮肤而排出体外。在整个过程中，肾中精气的蒸腾气化，特别是尿液的生成与排泄，起着关键作用，而气化作用的动力就是肾阳。AQP?1在全身各组织器官均有分布，起到介导水跨膜转运的作用，维持体内水代谢平衡。近年研究表明，水通道蛋白在肾、肺和消化系统等器官广泛存在，提示水通道蛋白与水代谢关系密切，而中医理论的肺、脾和肾等脏的水液代谢的作用与水通道蛋白的生化特性极为相似。本实验研究结果显示，与正常对照组比较，腺嘌呤模型组大鼠肾组织中AQP?1表达明显下降（P<0.05），而氢化可的松各剂量组均升高（P<0.05），提示肾阳对水液代谢的调节出现异常时，AQP?l表达也出现异常，由此推测水通道蛋白可能是肾阳虚证的物质基础之一。
【】
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