温阳活血方上调慢性马兜铃酸肾病大鼠肾组织血管生成素1 mRNA表达
作者：王红婷, 王云满, 梁永平, 刘育军, 彭文
【摘要】 目的：观察温阳活血方对慢性马兜铃酸肾病大鼠肾组织血管生成素（angiopoietin, Ang）表达的影响，并探讨其保护作用机制。
方法：将28只雄性SD大鼠随机分为正常对照组、模型组和温阳活血方组。模型组大鼠予关木通水煎液10 ml/(kg·d)灌胃，温阳活血方组于模型组基础上，再予温阳活血方30 g/(kg·d)灌胃。20周后，采用实时逆转录聚合酶链式反应方法检测3组大鼠肾组织中Ang?l和Ang?2 mRNA的表达。
结果：与正常对照组比较，模型组大鼠肾组织Ang?1 mRNA表达明显减少（P<0.01），Ang?2 mRNA表达明显升高（P<0.01）；与模型组大鼠比较，温阳活血方组大鼠肾组织Ang?1 mRNA表达升高（P<0.01），Ang?2 mRNA表达下降，但差异无统计学意义（P>0.05）；肾脏病理显示温阳活血方组肾损害较模型组明显减轻。
结论：温阳活血方通过上调Ang?1 mRNA的表达发挥对慢性马兜铃酸肾病大鼠肾脏保护作用。
【关键词】 马兜铃酸; 温阳活血方; 血管生成素类; 关木通; 大鼠; 肾病
Objective: To investigate the effects of Wenyang Huoxue Recipe (WRHXR), a compound traditional Chinese herbal medicine for warming yang and promoting blood flow, on the expression of angiopoietin mRNA in rats with chronic aristolochic acid nephropathy induced by Caulis Aristolochia Manshuriensis (CAM) decoction, and to explore the protection mechanism of WYHXR against kidney damage.
Methods: Twenty?eight male SD rats were randomly divided into normal control group, CAM group and WYHXR?treated group. Rats in the normal control group (n=8) and CAM group (n=10) were intragastrically administered with normal saline 10 ml/(kg·d) or CAM decoction 10 ml/(kg·d) respectively. Rats in the WYHXR?treated group (n=10) were intragastrically administered with WYHXR 30 g/(kg·d) and CAM decoction 10 ml/(kg·d). The expressions of Ang?l and Ang?2 mRNAs were detected by real?time reverse transcription polymerase chain reaction (RT?PCR) after 20?week treatment.
Results: Compared with the normal control group, the expression of Ang?l mRNA was significantly decreased, and the expression of Ang?2 mRNA was significantly increased in the CAM group (P<0.01). Compared with the CAM group, the expression of Ang?l mRNA was increased in the WYHXR?treated group (P<0.01). The expression of Ang?2 mRNA had no significant difference between the CAM group and the WYHXR?treated group (P>0.05). Renal pathology showed that renal damage in WYHXR?treated group was significantly reduced as compared with the CAM group.
Conclusion: WYHXR can up?regulate the expression of Ang?l mRNA, which may be its action mechanism in protecting the kidneys.
Keywords: aristolochic acid; Wenyang Huoxue Recipe; angiopoietins; Caulis Aristolochia Manshuriensis; rats; nephropathy
马兜铃酸肾病是一种由于服用含马兜铃酸的中草药所导致的快速进展的小管间质性肾病。1999年以来国内对本病的报告逐渐增多，成为肾脏科医生面临的一个新病种。由于发病原因、机制及临床预防、诊断、方面存在很多疑问，使其成为医学界关注的热点。研究发现，马兜铃酸可使肾血管发生明显病变，并导致管周毛细血管（peritubular capillary, PTC）丢失，PTC密度降低与肾功能减退和肾小管间质病变、纤维化程度密切相关［1］。血管生成素（angiopoietin, Ang）是一类关键性血管生长调节因子，在血管发育和损伤修复方面起重要作用［2, 3］，但其在马兜铃酸肾病中的作用并不清楚。我们前期研究表明，温阳活血方具有减少马兜铃酸肾病蛋白尿及改善肾组织病理改变的作用（文章待发表），但确切作用机制目前尚不清楚。本实验通过建立慢性马兜铃酸肾病大鼠模型，观察温阳活血方（Wenyang Huoxue Recipe, WYHXR）对马兜铃酸肾病大鼠肾组织中Ang?1和Ang?2 mRNA表达的影响，进而探讨温阳活血方保护肾脏的部分作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠28只，清洁级，8周龄，体质量180～200 g，由上海西普尔?必凯实验动物有限公司提供，动物许可证号为SCXK(沪)2003?0002。
1.1.2 实验药品及制备 关木通（Caulis Aristolochia Manshuriensis, CAM）由上海普陀区中心药剂科提供，产地东北。取关木通饮片60 kg，用清水漂洗以除去尘土及杂物，加等同药材8倍量的水煎煮2次，第1煎2 h，第2煎1.5 h，合并2次药液，经过滤和浓缩，使每毫升水煎液中含关木通生药4 g，分装于500 ml盐水瓶内，封口，以100 ℃流通蒸汽灭菌30 min，4 ℃保存备用。经上海食品药品检验所测定关木通水煎液中马兜铃酸A的浓度为0.26 mg/ml。温阳活血方由桃仁15 g、红花15 g、肉苁蓉30 g、仙灵脾15 g和牡丹皮15 g组成，水煎并浓缩至每毫升药液含生药量3 g。以上中药均由上海普陀区中心医院中药房提供，由制剂科中药制剂室制备成水煎剂。
1.1.3 主要试剂及仪器 TRIzol总RNA提取试剂盒由上海闪晶生物公司提供；RNA逆转录（reverse transcription，RT）试剂盒和实时逆转录聚合酶链式反应(real?time reverse transcription polymerase chain reaction, real?time RT?PCR)试剂盒(BK801)由日本TaKaRa公司提供。超净工作台（苏州净化仪器设备厂）；微量可调加样器、5804R型高速冷冻离心机和Biophotometer生物分光光度计（德国Eppendorf公司）；MDF?292型低温冰箱（SANYO公司）；YXQ.SGH.280型高压蒸气消毒器（上海医用核子仪器厂）；ABI?7300型Real?time检测仪(7300 Sequence Detection System)（美国ABI公司)。
1.2 实验方法
1.2.1 实验分组和给药方法 28只SD大鼠适应性饲养1周后，根据体质量按随机数字表分为正常对照组（8只）、模型组（10只）和温阳活血方组（10只）。正常对照组予10 ml/(kg·d)生理盐水灌胃；模型组予关木通水煎液10 ml/(kg·d)灌胃，上午，1次/d；温阳活血方组在模型组基础上，再予温阳活血方30 g/(kg·d)灌胃，下午，1次/d。各组大鼠每周称1次体质量，按体质量调整给药量，连续给药20周。实验过程中正常对照组死亡1只，模型组和温阳活血组大鼠各死亡2只。
1.2.2 肾组织病观察 治疗20周后处死大鼠，取肾脏组织，经10％中性福尔马林固定、脱水和石蜡包埋，切片3 μm厚度，常规HE和Masson染色，光镜观察肾脏组织病理学变化。
1.2.3 Real?time RT?PCR检测大鼠肾皮质Ang?1和Ang?2 mRNA表达 取50～100 mg肾皮质，用液氮碾成粉末，用TRIzol法抽提总RNA，用紫外分光光度计检测RNA浓度，即260 nm和280 nm波长时吸光度（absorbance, A），所有样品A260/A280比值在1.8～2.0之间。取1 μg总RNA逆转录成cDNA，反转录反应条件为37 ℃，15 min；85 ℃，5 s。将制备好的cDNA进行PCR扩增，反应体系为20 μl。甘油醛?3?磷酸脱氢酶（glyceraldehyde?3?phosphate dehydrogenase, GAPDH）、Ang?1和Ang?2引物及探针由上海闪晶生物公司提供。Ang?1上游引物：5'?TGA TGA GGA GAA GAG GCC TAA CC?3'；下游引物：5'?GCC CTT GTT GCC ATG GAT AA?3'；TaqMan探针：5'?FAM?CGC CCT GCA AAG AGG TCA ACA CC?TAMRA?3'。扩增片段长度406 bp。Ang?2上游引物：5'?GCG CCC TCT GTT GTT GGT T?3'；下游引物：5'?CGT CCT GAG CCA GAG TTG AAG?3'；TaqMan探针：5'?FAM?TTG TGC TGA GTC TGG TTG CGA?TAMRA?3'。扩增片段长度137 bp。以大鼠GAPDH为内参照，上游引物：5'?TGG AGT CTA CTG GCG TCT T?3'；下游引物：5'?TGT CAT ATT TCT CGT GGT TCA?3'；TaqMan探针：5'? FAM?CTG AAG GGT GGG GCC AAA AG?TAMRA?3'。扩增片段长度579 bp。反应条件如下：(1)预变性：95 ℃，10 s；(2)PCR反应：95 ℃，5 s；60 ℃，31 s，40个循环。采用Real?time检测仪自带ABI Prism 7300 SDS Software进行数据分析。目的基因mRNA相对表达水平用以下公式，mRNA相对表达量=2一△Ct。△Ct（cycle threshold）=Ct靶基因－CtGAPDH。
1.3 统计学方法 所有数据用SPSS 10.0统计软件分析处理，计量资料实验数据以x±s表示，多组比较采用单因素方差分析，方差齐者组间比较用最小显著差异t检验，方差不齐者用Games?Howell检验，P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 肾脏组织病理观察 给药20周后，从HE和Masson染色可以看出，正常对照组大鼠肾小管和肾间质基本正常；模型组大鼠肾小管上皮细胞变性，坏死脱落，基底膜裸露，部分肾小管萎缩或消失，肾间质伴有一定程度的纤维化；温阳活血方组大鼠可见部分肾小管上皮细胞变性，坏死脱落，间质纤维化程度减轻。见图1和图2。
2.2 肾皮质Ang?l和Ang?2 mRNA表达情况 与正常对照组比较，模型组大鼠肾皮质Ang?l mRNA表达水平显著下降（P<0.01），Ang?2 mRNA表达水平显著升高（P<0.01）；与模型组比较，温阳活血方组大鼠Ang?l mRNA水平升高，差异有统计学意义（P<0.01），温阳活血方组Ang?2 mRNA表达水平有降低趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
图1 各组大鼠肾组织病理切片（HE染色，×400）（略）
Figure 1 Pathological section of renal tissue in rats in three groups (HE staining, ×400)
A: Normal control group; B: CAM group; C: WYHXR?treated group.
图2 各组大鼠肾组织病理切片（Masson染色，×400）（略）
Figure 2 Pathological section of renal tissue in rats in three groups (Masson staining, ×400)
A: Normal control group; B: CAM group; C: WYHXR?treated group.
表1 各组大鼠肾组织Ang?l和Ang?2 mRNA表达（略）
Table 1 Expressions of Ang?1 and Ang?2 mRNAs in renal tissues of rats in three groups
**P＜0.01, vs normal control group; △△P＜0.01, vs CAM group.
3 讨论
马兜铃酸肾病的发病机制目前尚不清楚。研究发现，马兜铃酸可对肾小管产生严重损害，并使肾微血管发生改变，主要为管壁增厚、管腔狭窄和部分微小动脉管腔闭塞，呈肾缺血性改变，管周毛细血管密度明显下降，呈局灶性分布，在肾小管损伤、炎细胞浸润和纤维化病变严重的部位，管周毛细血管腔明显缩小或变形［1, 4, 5］，提示马兜铃酸肾病的发病机制与血管损伤和丢失有关。
Ang是近年来新发现的血管生成调节因子，在血管发育和创伤修复等方面起重要作用［4, 5］。Ang家族包括Ang?1、Ang?2、Ang?3和Ang?4，其受体主要是Tie?2。Ang?1主要由血管平滑肌细胞分泌，通过激活其受体Tie?2对血管生成和内皮稳定起调节作用，Ang?1过度表达能对抗由血小板活化因子和芥末油导致的血管渗漏［6］。Ang?2的功能主要是竞争性抑制Ang?1从而形成不稳定渗漏性的血管。当局部缺乏血管内皮生长因子时，Ang?2会通过抑制Ang?1诱导Tie?2的磷酸化发生退行性变，导致血管发生断裂，血管数目减少，同时伴有内皮细胞凋亡和平滑肌抗体的断裂，也可能在过程中形成原始血管［7］；而当血管内皮生长因子存在时，Ang?2则可以通过诱导毛细血管重塑、刺激内皮细胞出芽和迁移来促进新生血管形成。Ang?1可促进缺血组织中新生血管形成，还可通过对细胞外基质的降解，促进新的微血管形成和重塑。但在马兜铃酸肾病进展方面的意义还待研究。本研究结果显示，实验20周时，与正常对照组比较，马兜铃酸肾病肾组织中Ang?1 mRNA表达水平明显下调，而Ang?2 mRNA表达水平显著上调，提示马兜铃酸肾病发生发展可能与Ang有关。
温阳活血方由桃仁、红花、肉苁蓉、仙灵脾和牡丹皮组成。方中桃仁祛瘀活血，性平；红花活血袪瘀，性温；肉苁蓉补肾助阳，性温；仙灵脾补肾壮阳，性温；牡丹皮清热凉血、活血散瘀，性微寒。综观全方，攻补兼施，温凉并用，以温阳活血为特征，兼以清热解毒，使泻而不伤正，补而不滞邪。药理研究表明，桃仁能改善组织内纤维化，其作用机制在于提高组织血流量、改善微循环和提高组织胶原酶活性，从而促进胶原的分解和代谢，减少组织内的胶原含量，抑制肉芽形成［8］；肉苁蓉可增强阳虚小鼠的体液和细胞免疫功能，增强单核巨噬细胞吞噬能力［9］；牡丹皮具有抑制血小板聚集的作用，可防止血栓形成。本方集温、消、清、补四法为一体，从多层次、多环节和多靶点调理肾脏功能，改善肾纤维化的程度。本实验结果显示，温阳活血方上调马兜铃酸肾病大鼠肾组织Ang?1 mRNA表达水平，对Ang?2表达无影响，提示温阳活血方可能是通过上调Ang?1 mRNA表达而发挥肾保护作用。
【】
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