玄参和附子抗鼠心肌肥厚作用的对比实验研究
【摘要】 目的：探讨寒性药玄参和热性药附子对大、小鼠心肌肥厚及神经内分泌因子的影响。方法：采用注射异丙肾上腺素及L?甲状腺素两种方法分别制备小鼠和大鼠心肌肥厚模型。随机分为5组：正常组、模型组、美托洛尔组（或卡托普利组）、玄参组和附子组。灌胃给药干预7～9 d，称体质量后取血和心脏备用。称心脏质量测定左心室及全心质量指数；放射免疫法测定血浆环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）和心肌组织血管紧张素Ⅱ（angiotensinⅡ, AngⅡ）的水平；病理切片HE染色观察心肌细胞横断面面积大小。结果：寒性药玄参能显著改善心脏质量指数，降低cAMP、AngⅡ的含量，明显缩小心肌细胞横断面面积。而热性药附子则无此作用。结论：寒性药玄参能通过抑制心肌肥厚大鼠交感神经系统活性，降低AngⅡ水平而抑制心肌肥厚。而热性药附子抗心肌肥厚及抑制神经内分泌因子分泌的作用不显著。
【关键词】 玄参; 附子; 心肌病, 肥厚性; 对比研究; 大鼠; 小鼠
基金项目: 国家基金资助项目（No. 30572379）
Gu WL, Chen CX, Wang Y. J Chin Integr Med/Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao. 2008; 6(4): 376?380.
Received September 6, 2007; published online April 15, 2008.
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Forward linking and reference linking via CrossRef.DOI: 10.3736/jcim20080410Open Access
Comparative study of Scrophulariae and Aconite in inhibiting myocardial hypertrophy in rats and mice
Wei?liang GU, Chang?xun CHEN, Ying WANG
Department of Pharmacology, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China
Objective: To explore the effects of Scrophulariae of cold nature and Aconite of hot nature on myocardial hypertrophy and neuroendocrine factors in rats and mice.Methods: A mouse model of myocardial hypertrophy was established by hypodermic injection of isoproterenol. Sixty myocardial hypertrophy mice were randomly divided into five groups: normal control group, untreated group, metoprolol?treated group, Scrophulariae?treated group and Aconite?treated group. A rat model of myocardial hypertrophy was established by peritoneal injection of L?thyroxin. Fifty rats were randomly divided into five groups: normal control group, untreated group, captopril?treated group, Scrophulariae?treated group and Aconite?treated group. After 7?9 days of treatment with intragastric administration of the corresponding drugs, the effects of Scrophulariae and Aconite on left ventricular weight index (LVWI) and heart weight index (HWI) were determined. The concentrations of cyclic adenosine monophosphate (cAMP) in plasma and angiotensinⅡ (AngⅡ) in myocardium were detected through radio?immunity method. Cardiocyte cross?section area was determined by using HE staining. Results: Scrophulariae of cold nature could significantly reduce the LVWI, HWI and cardiocyte cross?section area, and could decrease the content of cAMP and AngⅡ. However, Aconite had no such effects.
Conclusion: Scrophulariae of cold nature can inhibit myocardial hypertrophy through restraining the activity of sympathetic nervous system and decreasing the level of AngⅡ. The inhibition of Aconite of hot nature on cardiac hypertrophy is not significant.
Keywords: Scrophulariae; Aconite; cardiomyopathy, hypertrophic; comparative study; rats; mice
心肌肥厚是心脏对长期负荷过重及神经内分泌过度激活的一种慢性代偿性反应，有较高的发病率。有学者认为心肌肥厚即使在早期也是一种有害的反应［1］。心肌肥厚是心力衰竭和猝死等心血管事件的独立危险因素。因此，尽早干预和逆转心肌肥厚显得非常重要。
中药寒、热、温、凉四种特性是传统中医药性理论的重要组成部分。中医学理论认为“寒为凉之甚，热为温之极”，寒与凉或温与热只有程度的差异而无本质上的区别，故从四性本质属性而言，只有寒热两性之分。中药基础理论研究工作者对中药寒热不同药性与其药效学关系的研究结果已初步发现，寒凉药一般表现为对交感神经系统产生抑制作用，而温热药则能使交感神经系统兴奋。持久的交感神经兴奋增强，除通过影响血流动力学或直接对心脏作用而诱发、加重心室重构外，还可引起肾素分泌过多，导致全身及心脏局部组织的肾素?血管紧张素?醛固酮系统（renin?angiotensin?aldosterone system, RAAS）活化，并进一步使交感神经兴奋性增强，过度激活神经内分泌，形成恶性循环［2］。
玄参（Scrophularia ningpoensis Hemsl.）性寒，味苦、甘、咸，具有清热凉血，滋阴解毒的功效；附子（Aconitum carmichaeli Debx.）性热，味辛、甘，具有回阳救逆，助阳补火，散寒止痛的功效。这两味药物寒热虽然不同，但报道两味药均有扩张冠状动脉［3］和增强心肌收缩力［4］的作用。为探索寒凉及温热不同药性对神经内分泌及心肌肥厚的发生、是否有不同影响，本文选择了玄参和附子进行对比研究。
1 材料与方法
1.1 动物
昆明种小鼠60只，雄性，体质量20～22 g，购于科学院上海实验动物中心，合格证号为SCXK（沪）2003?0003；SD大鼠55只，雄性，体质量220～250 g，购于中国科学院上海实验动物中心，合格证号为SCXK（沪）2003?0002。实验动物饲养于上海中医药大学实验动物中心SPF级动物实验室。
1.2 药品和试剂
玄参（产地浙江），制附子（产地江苏），购自上海养和堂中药饮片有限公司；盐酸异丙肾上腺素注射液（产品批号为5E20008），上海禾丰制药有限公司生产；酒石酸美托洛尔片（产品批号为0508031），阿斯利康制药有限公司生产；L?甲状腺素（产品批号为1131479），购自Sigma公司；卡托普利片（产品批号为051202，上海衡山药业有限公司生产）；环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate, cAMP）试剂盒，上海中医药大学科技实验中心核医学实验室；血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ, AngⅡ）试剂盒，北京北方生物技术研究所。
玄参和附子均分别用8倍量水煎煮3次，每次微沸30 min，合并3次滤液浓缩，冷藏备用。最终用量按每公斤给予的生药量。
1.3 模型制备及指标测定
1.3.1 异丙肾上腺素致小鼠心肌肥厚的观察
1.3.1.1 异丙肾上腺素制备小鼠心肌肥厚模型
60只20～22 g昆明种小鼠，随机分为5组，每组12只，分别为：正常组、模型组、美托洛尔组、玄参组和附子组（剂量按成人日用最高剂量，换算成动物等效量的20倍）。文献［5］制备小鼠心肌肥厚模型。除正常组外，各组连续7 d背部皮下注射异丙肾上腺素2 mg/（kg·d），1次/d，制成心肌肥厚模型；正常组小鼠同法背部皮下注射等量生理盐水。各给药组在给予异丙肾上腺素注射后当天灌胃给予玄参水煎液39 g/kg、附子水煎液39 g/kg和美托洛尔60 mg/kg；正常组、模型组灌胃给予等量生理盐水。连续给药7 d，于处理前禁食不禁水12 h，取血和心肌进行各项分析。
1.3.1.2 小鼠心肌质量指数的测定
称取小鼠体质量（body weight, BW），摘眼球取血备用，脱颈椎处死，快速打开胸腔取心脏，去除心房组织，分离左、右心室，生理盐水漂洗去血，用滤纸吸干表面水分，天平准确称取左心室质量（left ventricle weight, LVW）和全心质量（heart weight, HW）。计算左心室质量与体质量的比值（LVW/BW）、全心质量与体质量的比值（HW/BW），分别记为左心室质量指数（left ventricular weight index , LVWI）和全心质量指数（heart weight index, HWI）。
1.3.1.3 血浆cAMP含量测定
摘眼球取血，每管加乙二胺四乙酸二钠（disodium ethylenediamine tetraacetate, EDTA?2Na）溶液50 μl抗凝。低温离心机3 500 r/min离心10 min，取上清液待测cAMP含量。具体方法按试剂盒说明书进行。
1.3.1.4 心肌组织AngⅡ浓度测定
取小鼠的左心室中部心肌组织约40 mg，加入4 ml预冷的生理盐水在冰浴环境中快速匀浆，制备成1%的心肌组织匀浆，1 000 r/min离心5 min，取上清液测定AngⅡ浓度。具体操作方法见试剂盒说明书。结果以每毫升匀浆液中的AngⅡ含量表示。
1.3.2 L?甲状腺素致大鼠心肌肥厚的观察
1.3.2.1 L?甲状腺素制备大鼠心肌肥厚模型
55只220～250 g的雄性SD大鼠，随机分为5组，每组11只，分别为：正常组、模型组、卡托普利组、玄参组和附子组。参考文献［6］制备大鼠心肌肥厚模型。除正常组外，各组连续7 d腹腔注射L?甲状腺素0.25 mg/（kg·d），1次/d，制成心肌肥厚模型；正常组腹腔注射等量生理盐水。各给药组在给予L?甲状腺素后以玄参水煎液27 g/kg、附子水煎液27 g/kg和卡托普利40 mg/kg灌胃；正常组、模型组给予等量生理盐水灌胃。连续给药9 d，于处理前禁食不禁水12 h，取血和心肌进行各项分析。
1.3.2.2 大鼠心肌质量指数的测定
称取大鼠体质量后腹主动脉取血。取心脏，分离左右心室并分别称取其质量，计算LVWI和HWI。
1.3.2.3 心肌组织AngⅡ含量测定
取大鼠的左心室中部心肌组织约200 mg，加入2 ml生理盐水在冰浴环境中快速匀浆，3 500 r/min离心10 min，取上清200 μl加生理盐水800 μl，制备成2%的心肌组织匀浆，按AngⅡ试剂盒说明书操作，同时进行蛋白测定。结果以每毫克蛋白中的AngⅡ含量表示。
1.3.2.4 心肌细胞横断面面积测定
随机取8只大鼠，取左心室中段，10%福尔马林液固定的心肌组织经乙醇梯度脱水、透明、浸蜡包埋后，切成5 μm的切片，将左心室心肌进行HE染色，选择横断心肌的切片（细胞核清晰，细胞膜完整）放大400倍。用Image?Pro Plus 4.0图像分析软件，测量左心室心肌细胞横断面面积。每一标本随机测量20个心肌细胞，其细胞平均横断面面积。
1.4 统计学方法
实验数据以x±s表示，采用SPSS 13.0统计软件，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较正态分布者采用LSD检验，非正态分布者采用Mann?Whitney检验，以P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结 果
2.1 玄参和附子对异丙肾上腺素致小鼠心肌肥厚的影响
2.1.1 对心脏质量指数的影响
小鼠皮下注射异丙肾上腺素7 d后，模型组LVWI、HWI均较正常组升高，差异有统计学意义（P<0.01）；在用玄参和美托洛尔灌胃7 d后，LVWI和HWI均比模型组显著降低（P<0.01）。附子组LVWI和HWI无明显变化。见表1。表 1 玄参和附子对异丙肾上腺素致心肌肥厚模型小鼠心脏质量指数的影响（略）
2.1.2 对血浆cAMP浓度的影响
与正常组比较，模型组小鼠血浆中cAMP的含量明显升高（P<0.01）。与模型组比较，寒性药玄参组小鼠血浆cAMP的含量显著降低（P<0.01）。热性药附子组cAMP的含量与模型组比较，差异无统计学意义。见表2。
2.1.3 对心肌组织AngⅡ含量的影响
与正常组比较，模型组小鼠左心室心肌组织AngⅡ含量明显升高（P<0.01）。与模型组比较，寒性药玄参组小鼠左心室心肌组织AngⅡ含量降低，差异有统计学意义（P<0.01）。热性药附子组AngⅡ的含量与模型组比较，差异无统计学意义。见表2。表2 玄参和附子对异丙肾上腺素致心肌肥厚模型小鼠血浆cAMP和心肌组织AngⅡ含量的影响（略）
2.2 玄参和附子对L?甲状腺素致大鼠心肌肥厚的影响
2.2.1 对心脏质量指数的影响
模型组LVWI、HWI均比正常组升高（P<0.01）；在腹腔注射L?甲状腺素的同时用玄参和卡托普利灌胃9 d后，LVWI和HWI较模型组降低（P<0.01）。附子组的LVWI、HWI与模型组比较，差异无统计学意义。见表3。表3 玄参和附子对L?甲状腺素致心肌肥厚模型大鼠心脏质量指数的影响（略）
2.2.2 对心肌组织AngⅡ含量的影响
与正常组相比，模型组大鼠心肌组织中的AngⅡ含量升高，差异有统计学意义（P<0.01），玄参组和卡托普利组与模型组比较，左心室心肌组织中的AngⅡ降低（P<0.05）；附子组AngⅡ与模型组比较无明显变化。见表4。表4 玄参和附子对L?甲状腺素致心肌肥厚模型大鼠心肌组织AngⅡ含量的影响（略）
2.2.3 对心肌细胞横断面面积的影响
病理切片HE染色光镜下（×400倍）观察可见甲状腺素造模大鼠心肌较正常心肌细胞明显肥大、增宽，细胞间距增大，间质增生，组织横断面心肌纤维增多，经玄参后接近正常组，阳性药卡托普利组也接近正常组，而附子组与模型组比较无变化。每张图片取20个心肌细胞计算其平均细胞横断面面积（单位为软件自定义单位），经Image?Pro Plus 4.0图像分析系统分析统计。见表5和图1。表5 玄参和附子对L?甲状腺素致心肌肥厚模型大鼠心肌细胞横断面面积的影响（略）
3 讨 论
心肌肥厚和心衰通常呈现交感神经功能亢进和神经内分泌因子过度激活［2］。本实验采用异丙肾上腺素及L?甲状腺素两种方法制备小鼠及大鼠的心肌肥厚模型。这两种模型在国内外学术界已有广泛应用，方法可靠［5，6］，均能引起交感神经兴奋性增高、LVWI和HWI显著增加、cAMP生成代偿性增多以及心肌组织AngⅡ浓度提高等心肌肥厚的特征性改变。
本实验研究结果表明，寒凉药玄参有较明显的抗心肌肥厚作用，表现为降低LVWI和HWI。0.01 μmol/L异丙肾上腺素刺激培养心肌细胞，可升高细胞内cAMP浓度，刺激心肌细胞而使血管紧张素转换酶（angiotensin?converting enzyme, ACE）mRNA及蛋白表达显著增加，并使ACE活性和AngⅡ含量增加［7］。但此种慢性代偿性反应并非是有利的，持续过度的交感神经兴奋对心肌产生直接的毒性作用，在心力衰竭恶化过程中起着重要作用［8］。寒凉药玄参能降低cAMP、AngⅡ的含量和显著缩小心肌细胞横断面面积。平行实验显示，温热药附子抗心肌肥厚的作用则不明显。
中医整体观念强调“纠偏”作用，刘完素在其《素问玄机原病式·药略》一章中以“善假物之阴阳，以变化人身之阴阳也”体现中药四性的治疗原则。我们认为，大多数心力衰竭患者在疾病的初期，即心肌肥厚的发展时期，其“证”的本质是阴虚阳亢，采用养阴清热的治法应是合理的对证治疗，有利于调节机体神经内分泌系统，抑制其长期慢性激活，以使阴阳平衡，阻止心衰的发生和发展。
已有表明，抑制交感神经介质的合成和释放可能是寒凉药的基本作用之一［9］，而持久的交感神经兴奋增强，又引起肾素分泌过多、全身及心脏局部组织的RAAS活化［2］。本实验以玄参和附子为代表药进行抗心肌肥厚的实验研究，初步显示寒凉药玄参对心肌肥厚防治具有较好的疗效，这对寒性和热性药物比较实验研究做了有意义的探索。当然还需进行多个寒热不同药性药物之间的对比研究，以进一步说明寒凉药性对抑制神经内分泌过度激活和心肌肥厚所具有的影响。
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