小型猪心肌缺血血瘀证动物模型的复制方法
作者：许文玉, 王伟, 郭淑贞, 刘涛, 刘蕾, 于永新
【摘要】 目的：建立中华小型猪心肌缺血血瘀证的模型。方法：在小型猪左冠状动脉前降支第一间隔支起始部远端放置Ameroid缩窄环，使Ameroid缩窄环内层缓慢膨胀压迫冠状动脉，造成慢性心肌缺血模型。术后，对动物的行为改变、一般情况及血液流变学指标等进行动态观察。结果：手术后4周冠状动脉造影显示心肌缺血小型猪冠状动脉狭窄率大于75％，其行为及一般情况、舌象和血液流变学指标等与术前和同期假手术组相比，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：术后4周，该模型之证候属于中医血瘀证范畴，而且其发病过程与人类慢性心肌缺血的病理过程相似，适用于心肌缺血血瘀证的研究。
【关键词】 心肌缺血; 血瘀; 模型, 动物; 小型猪
Objective: To establish an animal model of myocardial ischemia with blood stasis syndrome in mini?swines.Methods: An animal model of myocardial ischemia was established in mini?swines by oppressing the coronary artery through the expansion of inner layer of Ameroid constrictor and the Ameroid constrictor was implanted into the distal end of the initial part of the first branch of interventricular septum of ramus descendens anterior arteriae coronariae sinistrae. Dynamic observation of behavior changes, general health status and changes of hemorheological parameters in the mini?swines were made after operation.Results: The coronary angiography showed that the stenosis rate in ischemic group was more than 75% four weeks after operation. Compared with before operation and sham?operated group, there were great changes of behavior, general health status, tongue color and hemorheological parameters in ischemic group (P<0.05).Conclusion: The animal model of myocardial ischemia with blood stasis syndrome in mini?swines was established successfully 4 weeks after operation. The pathological process in the animal model is similar to that in the patients with chronic myocardial ischemia. So this model can be adopted in the research of myocardial ischemia with blood stasis syndrome.
Keywords: myocardial ischemia; blood stasis; models, animal; minipigs
证候是中医学认识疾病的主要模式，也是中医诊疗疾病的基石，证候研究一直是中医科研中的重点和难点［1?3］，合适的证候动物模型是中医药研究获得突破性进展的关键。本研究以冠心病血瘀证作为切入点，构建冠心病（心肌缺血）血瘀证动物模型，以便更方便、更有效地认识冠心病血瘀证的，进一步指导临床实践。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 动物与分组
动物为农业大学育种健康中华小型猪，体质量（25±5）kg，月龄6～10个月，雌雄不限，共27只。随机分为假手术组11只和模型组16只；存活至实验终点且无伤口感染的动物共19只，其中假手术组10只，模型组9只。
1.1.2 试剂
安尔碘，上海利康消毒高科技有限公司，批号为20050808；盐酸氯胺酮注射液，江苏恒瑞医药股份有限公司，批号为KH050302；复方泛影葡胺注射液（X线造影剂），上海旭东海菁药业，批号为041003。
1.1.3 仪器
便携式心电图机，福田FX?7202，日本；超声诊断仪，惠普Agilent SONOS 5500，美国；冠状动脉造影仪，Cardicav GE OEC 9800，美国；电脑高频电刀，康威CV?2000，北京；内径2.75 mm的Ameroid缩窄环，Research Instrument SW，美国；比色卡，Casmatch，日本。
1.2 实验方法
1.2.1 模型的复制方法
［4］制备小型猪心肌缺血血瘀证模型。小型猪术前禁食24 h后，肌肉注射氯胺酮25 mg/kg诱导麻醉，并建立耳缘静脉通路维持。经口行气管插管，插管成功后接呼吸机进行辅助呼吸，潮气量为12 ml/kg（300 ml），呼吸频率为14次/min，呼吸比为1∶2，氧浓度为200～400 ml/min。耳静脉插管恒速输入生理盐水（20滴/min）以补充血容量。
猪右侧卧位，连接心电图肢体导联，左侧第4肋间前外侧切口，切口尽量要小，约5 cm。撑开肋间隙勿太大，以防肋骨断裂。逐层进胸，注意保护左肺，剪开心包，以无损伤卵圆钳夹住上提左心耳，暴露冠状动脉，剪开此处的心外膜，分离并游离出左冠状动脉前降支第一间隔支起始部长约1 cm，避免损伤伴行的冠状静脉，用两线平移牵引法将左冠状动脉前降支第一间隔支起始部远端与Ameroid环的缺槽平行对齐，立即将两者同时做相反方向的运动，迅速将其套入Ameroid环内。缝合心包，放置胸腔闭式引流管，逐层关胸。动物麻醉苏醒且自主呼吸平稳后，首先拔除气管插管，待呼吸、心率平稳后，引流管无气体排出，用手动式呼吸球囊膨肺3～4次，以防止肺不张的发生，最后拔除胸腔闭式引流管。术后肌肉注射青霉素480万U，1次/d，共3 d。假手术组动物不放置Ameroid环，其他操作均与模型组一致。
1.2.2 心肌缺血血瘀证模型的评价
根据报道［5］，Ameroid环在体内吸收水分后，均匀地向内收缩，导致血管进行性狭窄甚至完全闭塞，一般需要2～4周时间。术后对动物进行动态观察，参照1986年中西医结合研究会活血化瘀专业委员会制订的血瘀证诊断标准［6］，确定心肌缺血血瘀证出现及稳定的时间点。
1.2.3 观察指标
采用冠状动脉造影的方法观察冠状动脉的狭窄程度；术后动态观察小型猪的行为改变及一般情况、舌象和血液流变学指标的变化。
1.3 统计学方法
统计处理采用SPSS 12.0软件。数据结果以x±s表示，组间比较采用t检验，多重比较采用重复测量方差分析。P<0.05认为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 行为改变及一般情况
术前，所有小型猪性情活泼，不时拱地，被毛光润，鼻盘湿润，目光明亮有神，行走时尾巴不时摆动，贪食，当人呼唤叫食时，即应声而望或速向食槽而来，饱后多睡卧，舌色淡红、淡白，舌体可见裂纹，湿滑，舌苔薄。术后第3～4周，模型组动物出现精神紧张，易激惹，怕人，不易接近，冲撞笼栏；被毛杂乱、无光泽；耳凉；粪便干燥；舌色渐呈苍白、暗红、青紫色，舌体有裂纹，湿滑，舌苔腻，而假手术组动物术后未发现异常情况。
2.2 舌象
用数码相机拍摄术后各周的舌象和比色卡的红（red, R）、绿（green, G）、蓝（blue, B）3种颜色的照片，Adobe Photoshop 8.0软件分析舌象，分析取样点R、G、B各分量值与其总和的比值，分别称为R比、G比和B比。结果显示，术后3、4周，模型组舌象的R、G和B比与术前比较明显下降，差异有统计学意义（P<0.05或P<0.01）；模型组舌象的B比在术后第3周与同期假手术组B比比较，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。表1 小型猪手术前后舌象R、G和B比的变化（略）
2.3 冠状动脉造影
冠状动脉造影检查是冠心病诊断的金标准，冠状动脉狭窄率＞75%，就可以诊断为冠心病。术后4周对所有动物进行冠状动脉造影，左冠状动脉畸形或狭窄率≤75%的从模型组中剔除。见图1和图2。
2.4 血液流变学检测
模型组术后各周全血黏度与术前相比明显增加（P<0.05或P<0.01）；压积测定值在术后有所增加，与术前和同期假手术组比较，手术2、3、4周后压积测定值增加明显（P<0.05或P<0.01）；红细胞变形指数和变形指数积分面积于术后下降，与术前相比，手术3周后红细胞变形指数和变形指数积分面积明显下降（P<0.05）。见表2～表4。表2 手术前后全血黏度的变化（略）表3 手术前后血浆黏度和压积测定值的动态变化（略）表4 手术前后红细胞聚集指数和聚集指数积分面积以及变形指数和变形指数积分面积的变化（略）
3 讨 论
证候是疾病发生和演变过程中某阶段本质的反映，是用来分析和表述机体功能状态的概念体系，是中医学认识疾病的主要模式，也是中医诊疗疾病的基石，是中医科研中的重点和难点［1?3］，合适的证候动物模型是中医药研究获得突破性进展的关键。目前，证候动物模型的制备方法主要有以下几种：病理型模型、病因型模型、症状型模型和病因病理结合模型（病证结合的动物模型）。经过长期探索，目前普遍认为病证结合动物模型是适合中医药研究的模型。本研究以冠心病血瘀证作为切入点，探讨了构建冠心病（心肌缺血）血瘀证动物模型的方法，在评价模型成功与否时，主要参照冠状动脉造影金指标和1986年中国中西医结合研究会活血化瘀专业委员会制订的血瘀证诊断标准。
本实验采用小型猪为实验对象，因实验小型猪的心脏解剖结构及侧枝循环与人类相似；被毛稀少，皮肤组织结构和人最相似，便于观察皮肤变化；最大的优点是可按中医辨证施治要求作舌诊观察，用相机记录病程中舌象的变化；还可以多次反复大量采取血液和其他体液，便于动态观察血液流变学和其他生化指标，这是其他动物难以相比的。证候是疾病发生和演变过程中某阶段本质的反映，为确定血瘀证出现的时间，我们动态观察了小型猪的行为改变、一般情况和血液流变学指标等，还用数码相机拍摄了舌象和比色卡（Casmatch），运用Adobe Photoshop 8.0软件进一步分析舌象的R比、B比和G比，结果发现模型组术后4周，R比明显下降，B比显著升高，G比变化不明显。结果提示，舌象软件分析结果与肉眼观察结果以及血液表现出的高浓、高黏、高聚和高凝状态的结果基本一致。中医学认为，舌为心之苗，心开窍于舌，舌的变化与心的功能关系密切。术后4周，动物模型舌色呈现青紫样改变，我们认为，该疾病模型此阶段之证候属于中医血瘀证。
【】
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