血府逐瘀胶囊对急性心肌梗死再灌注后心肌及内皮素
作者：侯霄雷, 李白翎, 赵雷, 黄盛东, 徐志云, 张冠鑫
【摘要】 目的：观察血府逐瘀胶囊对急性心肌梗死（acute myocardial infarction, AMI）再灌注后心肌组织及一氧化氮（nitric oxide, NO）/一氧化氮合酶（nitric oxide synthase, NOS）体系和内皮素?1（endothelin?1, ET?1）的影响，探讨其改善血管内皮功能的机制。方法：Yorkshire猪45只，随机分成假手术组、模型对照组和血府逐瘀胶囊组。开胸结扎左冠状动脉前降支90 min后，松解2 h制备AMI再灌注模型。测定造模前后和再灌注后血清ET?1和NO的含量；冠状动脉造影观察心肌血流恢复情况；Western blot分析心肌组织内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase, eNOS）和ET?1蛋白表达；病分析心肌组织形态变化。结果：血府逐瘀胶囊组造模后和再灌注后血ET?1水平低于模型组（P<0.01），而NO表达水平明显高于模型组（P<0.01）。冠状动脉造影提示治疗组冠状动脉血流通畅情况优于对照组，但结果没有统计学意义（P＝0.253）。Western blot显示血府逐瘀胶囊组eNOS蛋白表达较模型组有所提高，ET?1蛋白表达则有所下降（P<0.01）。HE染色及微血管密度分析显示与模型对照组相比，血府逐瘀胶囊组毛细血管扩张程度明显减轻，心肌组织损伤明显改善，微血管密度明显增加。结论：内皮细胞受损可能是无再流现象发生的重要机制之一，血府逐瘀胶囊可能通过调控NO和ET?1基因表达来达到对AMI的治疗作用。
【关键词】 血府逐瘀胶囊; 内皮缩血管肽?1; 一氧化氮; 一氧化氮合酶; 心肌梗死
Objective: To observe the effects of Xuefu Zhuyu Capsule (XFZYC), a compound traditional Chinese herbal medicine, on endothelin?1 (ET?1) release in myocardium and vascular endothelium and nitric oxide (NO)/nitric oxide synthase (NOS) system of swines after acute myocardial infarction (AMI) and reperfusion, and to explore the action mechanisms of XFZYC in improving the endothelium function.
Methods: Forty?five Yorkshire swines were randomized into 3 groups: sham?operated group, untreated group and XFZYC?treated group. A Yorkshire swine model of reperfusion in AMI was established by ligation of left anterior descending coronary artery for 90 min followed by 2 h relaxation. The content of serum ET?1 and NO was measured by radioimmunoassay before and after AMI and after reperfusion, respectively. Twenty?four hours after operation, all Yorkshire swines underwent diagnostic coronary angiography to delineate coronary arteries. The expressions of ET?1 and endothelial nitric oxide synthase (eNOS) in myocardial tissue of ischemic area were quantified with Western blotting. Microvessel density of the implanting sites was assessed by using HE staining.Results: Compared with the untreated group, the levels of serum ET?1 after AMI and reperfusion were significantly decreased in XFZYC?treated group (P<0.01), while the NO levels after AMI and reperfusion in XFZYC?treated group were significantly increased (P<0.01). There was no significant difference in diagnostic coronary angiography between XFZYC?treated group and untreated group (P＝0.253). Western blotting showed that the level of ET?1 in ischemic area in XFZYC?treated group was lower than that in the untreated group (P<0.01), while the eNOS protein expression in XFZYC?treated group was higher than that in the untreated group (P<0.01). The results of HE staining and microvessel density analysis of the implanting sites all showed that the degree of telangiectasis was reduced, the cardiac muscle damage was improved, and the density of capillaries was increased obviously in XFZYC?treated group as compared with the untreated group.Conclusion: The endothelium injury may be one of the important mechanisms for no?reflow phenomenon. XFZYC may reduce the no?reflow by protecting endothelium cells.
Keywords: Xuefu Zhuyu Capsule; endothelin?1; nitric oxide; nitric oxide synthase; myocardial infarction
急性心肌梗死（acute myocardial infarction, AMI）的早期血运重建治疗（溶栓或经皮冠状动脉介入治疗）是心肌恢复再灌注最有效的方法。但冠状动脉成功再通后，缺血再灌注损伤使约30%的患者并发无再流（no?reflow）现象或慢血流（slow?flow）现象等灌注不良，而未能真正地恢复心肌细胞水平的有效再灌注，从而影响心脏功能的恢复，增加AMI的住院死亡率和再梗死的发生［1，2］。目前，血管内皮细胞损伤及功能紊乱与AMI之间的关系日益受到重视，能否保持心肌微血管的完整性和预防再灌注损伤已成为再灌注治疗关注的重点。血府逐瘀胶囊是根据中医络病理论研制而成的复方制剂，对血管内皮有保护作用。本研究拟构建猪AMI再灌注模型，观察AMI再灌注后血府逐瘀胶囊对内皮素?1（endothelin?1, ET?1）及一氧化氮（nitric oxide, NO）/一氧化氮合酶（nitric oxide synthase, NOS）体系变化的影响，以及缺血再灌注区心肌组织的病理改变，为血府逐瘀胶囊在AMI治疗中的应用提供依据。
1 材料和方法
1.1 动物与分组
选用Yorkshire猪45只（第二军医大学实验动物中心提供），雌雄不拘，体质量28～35 kg，随机分为3组：组Ⅰ（n=15）为假手术组；组Ⅱ（n=13）为模型对照组；组Ⅲ（n=14）为血府逐瘀胶囊治疗组。共有3只猪在建立动物模型的过程中死亡。
1.2 药物与用法
血府逐瘀胶囊主要成分为桃仁、红花、当归、川芎、赤芍、生地、柴胡、枳壳、牛膝、桔梗、甘草等。组Ⅲ每头猪均单独笼内饲养，将血府逐瘀胶囊（天津宏仁堂药业有限公司生产，0.4 g/粒，相当于含生药0.675 g）于造成AMI模型前15 d开始每天晚间混于饲料中喂食给药1次，剂量为0.2 g/（kg·d）。
1.3 模型建立方法
所有实验猪静脉注射氯胺酮5 mg/kg，气管插管，2％异氟醚维持麻醉，第3肋间进胸。组Ⅱ及组Ⅲ的猪游离冠状动脉左前降支（left anterior descendens, LAD），在LAD远端1/2～1/3处穿引4～0号丝线，在心电监护下将结扎线向外收紧，固定好结扎线造成冠状动脉血流中断，建立AMI模型［3］。供血区心肌颜色由鲜红转为暗紫，心电图示ST段弓背向上抬高大于0.5 mV，局部心肌变成紫红色并有节段性运动不良，证实闭塞有效，同时用丝线标记缺血区。90 min后放松结扎线，冠状动脉再通形成，再灌注120 min。以松开结扎前后ST?T下降50%以上，局部心肌变红，为缺血再灌注模型成功。组Ⅰ只开胸游离出LAD，不结扎。常规关胸，术后常规饲养，注射先锋霉素2.0 g。
1.4 血清ET?1和NO检测
每只动物分别于AMI前和AMI后90 min、再灌注后60 min及再灌注后120 min，从耳缘静脉抽血。NO检测，采用NO－2/NO－3含量测定化学法，NO试剂盒由深圳晶美科技有限公司提供。操作严格按照试剂盒说明书进行。ET?1测定，取血3 ml，注入含10％乙二胺四乙酸二钠30 μl和抑肽酶40 μl的试管中，4 ℃ 3 000 r/min离心10 min分离血清。血清ET?1检测采用放射免疫方法。具体操作按放射免疫试剂盒说明书进行，试剂盒购自北京东亚免疫技术研究所。
1.5 冠状动脉造影血流情况分析
手术24 h后，行冠状动脉造影检查，观察LAD血管再通及血流情况。以冠状动脉造影血流分级法（thrombolysis in myocardial infarction, TIMI）作为冠状动脉造影诊断标准。TIMI血流分级法评价冠状动脉血流的标准如下。0级：血管闭塞远端无前向血流；1级：造影剂部分通过闭塞部位，但不能充盈远端血管；2级：造影剂可完全充盈冠状动脉远端，但造影剂充盈及清除的速度较正常冠状动脉延缓（3个心动周期以上）；3级：造影剂完全、迅速充盈远端血管并迅速清除（通常在3个心动周期以内）。其中3级为正常冠状动脉血流，0或1级为无复流，2级为慢血流。检查结束，静脉推注10%氯化钾20 ml处死动物，立即取出心脏，取缺血区心肌保存于液氮中备用。
1.6 Western Blot检测心肌组织ET?1及内皮型一氧化氮合酶表达
取心肌组织裂解后，提取总蛋白，紫外分光光度计法进行蛋白质定量。蛋白质上样量每泳道均为100 μg，进行12％十二烷基磺酸钠?聚丙烯酰胺凝胶电泳（Bio?Rad, USA），以蛋白质电泳转移仪（Bio?Rad, USA）将产物转至硝酸纤维素膜上，室温封闭2 h，加入1∶1 000兔抗人ET?1抗体或兔抗人内皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase, eNOS）抗体（Santa Cruz, USA），4 ℃反应过夜，PBS洗膜，加入1∶4 000辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG，室温孵育1.5 h，用化学发光试剂反应5 min，发光成像仪取像。
1.7 心肌组织常规HE染色及微血管密度分析
石蜡切片脱蜡至水，苏木素染色15 min，自来水冲洗，放入分色液（每100 ml 70 %乙醇含0.25 ml浓HCl）中分色30～40 s，用水返蓝15 min，甩干。伊红染色2 min。95%乙醇洗脱5 min，无水乙醇洗脱5 min×2，最后滴加中性树脂胶封片。微血管密度（microvessel density, MVD）计数：连续石蜡切片脱蜡至水，0.3%过氧化氢溶液室温下孵育10 min，加兔抗人Ⅷ因子多克隆抗体，37 ℃孵育1 h，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗，37 ℃ 孵育30min，DAB液显色，苏木素衬染，在光学显微镜下行MVD计数。在200倍镜下计数5个热点区的血管数，取其平均值作为该样本的MVD。
1.8 统计学方法
应用SPSS 12.0版统计软件包完成。数据用x±s表示。分类变量用卡方检验。连续变量采用方差分析。检验水准α=0.05。
2 结 果
2.1 各组各时间点血清ET?1及NO水平
假手术组（组Ⅰ）各时间点的血清ET?1及NO水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）。AMI前，各组血ET?1及NO水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）。与造模前比较，模型组（组Ⅱ）AMI后90 min、再灌注后60 min及再灌注后120 min血ET?1均显著升高（P<0.01），且呈递增趋势。与组Ⅰ相比，组ⅡAMI后各时间点血ET?1水平显著升高（P<0.01）。血府逐瘀胶囊组（组Ⅲ）AMI后90 min、再灌注后60 min及再灌注后120 min的血ET?1水平均明显低于组Ⅱ（P<0.01），提示血府逐瘀胶囊对心肌内皮功能有保护作用。与组Ⅰ相比，组ⅡAMI后各时间点血NO水平显著降低（P<0.01）。组Ⅱ AMI后各时间点血NO水平与造模前比较显著降低（P<0.01），然而再灌注后血NO水平虽较造模后90 min有所恢复，但差异无统计学意义（P>0.05）。与组Ⅰ相比，组Ⅲ AMI后90 min血NO水平有所降低（P<0.05），但AMI后各时间点血NO水平比较，差异无统计学意义（P>0.05）；组Ⅲ造模后各时间点血NO水平与组Ⅱ相比明显升高，差异有统计学意义（P<0.01），同样也提示血府逐瘀胶囊对心肌内皮功能有保护作用。见表1和表2。表1 各组造模前后血清ET?1水平（略）表2 各组造模前后血清NO水平（略）
2.2 血流恢复情况分析
运用冠状动脉造影观察血流恢复情况，冠状动脉造影显示冠状动脉血流达到TIMI 3级为有效，TIMI 2级及以下为无效。见图1。2组冠状动脉血流变化显示，组Ⅲ冠状动脉血流通畅情况优于组Ⅱ，但差异没有统计学意义（P＝0.253），这可能是由于分析的样本量较小，存在抽样误差所致。见表3。表3 冠状动脉造影结果分析血流恢复情况（略）
2.3 心肌组织ET?1及eNOS表达 Western Blot分析检测
结果显示，与组Ⅱ相比，组Ⅲ ET?1表达明显降低（P<0.01），eNOS表达明显提高（P<0.01），提示血府逐瘀胶囊具有内皮保护功能。见表4。表4 各组心肌组织ET?1及eNOS蛋白表达（略）
2.4 病理形态学检测结果
与组Ⅱ相比，HE染色显示组Ⅲ毛细血管扩张程度明显减轻，炎症细胞浸润和心肌损伤程度也明显减轻。见图2。MVD分析显示组Ⅲ微血管开放数量明显高于组Ⅱ（P<0.01）。见图3。提示血府逐瘀胶囊可以明显抑制心肌局部炎症浸润，减轻内皮细胞和心肌组织的损伤。
3 讨 论
无再流现象（no?reflow phenomenon）是指AMI冠状动脉再通后，心肌组织再灌注并不完全，甚至出现无再灌注，其发生的病理生理机制与微血管痉挛、栓塞或血栓形成以及微血管内皮细胞功能和结构完整性受损密切相关［4］，表现为血管内皮损伤及分泌生物活性物质平衡失调，缩血管物质（ET?1）增多，内皮来源的舒血管物质（NO）分泌减少，因而导致持续的血管收缩而加重心肌缺血和损伤［5］。因此防治无再流的关键在于保护心肌微血管结构和功能的完整性。现已证实冠状动脉和心肌细胞均有ET受体，对于心血管起主要作用的是ET?1，而ET?1在高浓度时会导致显著的血管收缩，尤其在心肌缺血再灌注过程中，会引起冠状动脉的收缩和严重的心肌损害［6，7］。NO是在NOS的催化下由L?精氨酸和氧生成，心脏中NOS有3种同工酶，即eNOS、神经型NOS和诱导型NOS，生理情况下心脏中绝大多数为eNOS。基础状态下NO在心肌缺血?再灌注损伤中对心肌起保护作用。血管组织中NO重要的生理作用在于它能改变血管的基础张力，调节血压和组织血流量，以及抑制血小板的黏附和聚集，维持血流畅通［8］。
从中医临床证候演变及转归来看，冠心病、AMI属于中医“胸痹心痛”、“真心痛”、“厥心痛”、“脱证”和“喘证”等病的范畴。血府逐瘀汤，源出清代王清任所著《医林改错》，全方由桃仁、红花、当归、川芎、赤芍、生地、柴胡、枳壳、牛膝、桔梗、甘草组成，为治疗瘀血内阻胸部、气机郁滞所致胸痛、胸闷的方剂，即王清任所称“胸中血府血瘀”之证。血府逐瘀汤是通过降低心肌耗氧量和增加心肌供血来明显减轻心肌缺血程度，缩小心肌缺血及梗死区范围，促进侧枝循环［9，10］，并可改善缺血心肌的代谢抑制状态，增强心肌对缺血缺氧的耐受力［11］。在大动物实验中有保护犬急性心肌缺血心脏的泵血功能的报道［12］。
本研究结果显示，模型组造模后90 min时血ET?1水平显著升高，提示心肌缺血后内皮细胞储存的ET?1释放迅速。再灌注后60 min和120 min血ET?1水平持续升高，提示再灌注后ET?1合成和释放增多。与假手术组对比，模型对照组AMI后各时间点血NO水平显著降低（P<0.01）。而目前研究己证明，ET与NO之间存在着负反馈调节作用，而升高的ET可通过其B受体而促进NO释放，增加局部NO的浓度，升高的NO则经环磷酸鸟苷途径抑制ET的产生，最终使ET与NO的合成释放处于动态平衡，二者比值保持在一个较稳定的水平。心肌缺血再灌注时由于血管内皮细胞受损，ET释放增加，血浆和心脏组织内ET水平急剧增高；心肌缺血再灌注时心肌细胞膜ET受体密度增加，心肌和冠状动脉对ET的反应性增强，导致再灌注时“无复流现象”的发生，提示ET可能参与心肌再灌注损伤的发病过程，ET增高可加重缺血心肌损害，使冠状动脉血流量锐减，促进心肌梗死的扩展［13，14］。心肌缺血?再灌注损伤对血管内皮的结构性损害能抑制内皮细胞生成NO，氧自由基直接使NO失活，导致微血管收缩或扩张储备障碍，使血管舒张功能减弱，增强了血管痉挛趋势［5］。
本实验中，血府逐瘀胶囊治疗组各时间点（除造模前）的血ET?1水平均显著低于模型组，提示血府逐瘀胶囊可减轻内皮受损程度，从而减少ET?1的合成释放。同时，血府逐瘀胶囊治疗组造模后各时间点血NO水平与模型对照组相比明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）。而对缺血再灌注区心肌组织ET?1和eNOS蛋白质水平的分析也进一步证实了血府逐瘀胶囊对血管内皮的保护作用。病检查结果提示血府逐瘀胶囊治疗组与模型对照组相比，血府逐瘀胶囊组毛细血管扩张程度明显减轻，炎症细胞浸润和心肌损伤程度也明显降低。MVD分析显示治疗组微血管开放数量明显高于对照组（P<0.01），说明血府逐瘀胶囊可保护血管内皮功能，维护心肌微血管完整性，改善心肌内微循环，增强心肌内血流灌注速度。血府逐瘀胶囊对AMI再灌注时的微血管内皮细胞功能及其完整性有显著的保护作用，其保护作用可能是通过NO和ET?1的介导来实现。
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