肾络瘀阻证患者肾间质中α-SMA的表达及意义

                         作者：杨东, 杜永平, 沈青, 陈威, 于艳, 陈光磊

【关键词】  肾病; 纤维化; α肌动蛋白; 成纤维细胞

      Objective: To investigate the expression of α-smooth muscle action (α-SMA) in the renal tubulointerstitium in patients with kidney collateral stasis.

    Methods: The expression of α-SMA in the renal biopsy specimens from 54 patients with kidney collateral stasis was examined by immunohistochemical method.

    Results: The degree of kidney collateral stasis was increased with the increasing of the degree of renal interstitial fibrosis (P＜0.05), and there was significant positive correlation between kidney collateral stasis and α-SMA expression (P＜0.05).

    Conclusion: Kidney collateral stasis is one of the main reasons of renal fibrosis. With the increasing of kidney collateral stasis, MFBs in the renal interstitium proliferate obviously, becoming one of the most important causes of renal interstitial fibrosis.

    Keywords: nephrosis; fibrosis; alpha actin; fibroblasts

    肾间质纤维化（renal interstitial fibrosis, RIF）是指由多种原因引起的细胞外基质（extracellular matrix, ECM）成分在肾间质过度沉积，它几乎是各种肾脏疾病进展到终末期肾衰竭的共同途径和主要病理基础［1］。因此，拮抗肾纤维化，延缓肾衰竭的发生、，一直是研究的重要方向。研究证实，多种因素参与肾间质纤维化的过程，其中肌成纤维细胞（myofibroblast, MFB）是引发肾间质纤维化的一个重要因素。

    祖国传统医学认为瘀血是肾间质纤维化的基本病机之一，贯穿疾病始终，活血化瘀法（补脾肾活血化瘀法、活血化瘀解毒法、活血化瘀养血生血法等）可用于慢性肾间质纤维化全过程的。因此，我们通过检测MFB的标志蛋白α平滑肌肌动蛋白（alpha-smooth muscle actin, α-SMA）在患者肾活检标本的表达，研究肾络瘀阻证与MFB之间的关系以探讨肾间质纤维化的发生机制，并为活血通络治疗提供实验依据。

    1  资料与方法

    1.1  临床资料  选择第四军医大学西京2006年9月至2007年3月肾内科做肾活检的住院患者54例为研究对象，其中男26例，女28例。临床诊断为免疫球蛋白A（immunoglobulin A, IgA）肾病16例，IgM肾病3例，狼疮性肾炎6例，紫癜性肾炎7例，肾病综合征9例，间质性肾炎2例，糖尿病肾病4例，隐匿性肾炎2例，乙肝相关肾病3例，高血压肾病2例。所选患者均有不同程度的肾间质纤维化，并且按照其纤维化程度分为轻度、中度和重度组。各组每位患者的血瘀指数。

    1.2  肾间质纤维化的评价  肾活检组织经中性缓冲液福尔马林固定，常规石蜡包埋，切片3 μm进行Masson三色染色。在MPIAS-500彩色病理分析系统下计算肾间质纤维化指数：高倍镜（×200）下随机选10个不重叠视野，测定间质纤维化面积占同视野小管间质总面积的百分比。积分如下：无病变为0分；小于25％为1分，25%～50％为2分，大于50％为3分。每张切片取10个视野平均积分，再在各组内取平均值。

    1.3  血瘀指数计算  所有病人均血瘀证诊断标准［2］，将肾络瘀阻证有关临床表现列为10项：（1）面色黧黑或晦暗；（2）腰痛固定，隐痛或刺痛；（3）肌肤甲错或肢体麻木或爪甲青紫；（4）舌色紫暗或有瘀点、瘀斑，舌下筋系瘀紫；（5）脉象细涩；（6）血纤维蛋白原含量增高；（7）B超示肾脏内血流压力改变；（8）血液流变学检测全血黏度或血浆黏度升高；（9）鼻衄及齿衄；（10）血尿。每项1分，计算总积分，每位患者所得总分作为血瘀指数来判断血瘀程度，≥3分诊断为肾络瘀阻证，其中以有无血尿以及血纤维蛋白原含量是否增高作为主要诊断依据。

    1.4  免疫组化检测  小鼠抗人α-SMA单克隆抗体购于武汉博士德公司。兔抗小鼠免疫组化SP即用型试剂盒购于北京中山公司。石蜡切片厚3 μm，二甲苯脱腊，梯度酒精依次脱水，0.3％ H2O2室温孵育30 min，蒸馏水冲洗，10％山羊血清封闭37 ℃ 1 h，按1∶150比例加入一抗4 ℃过夜，37 ℃复温1 h，多聚-L-赖氨酸和磷酸盐缓冲液（PBS）洗5 min×3次，加入二抗37 ℃ 1 h，PBS洗5 min×3次，3,3-二氨基联苯胺盐酸盐（3,3-diaminobenzidine, DAB）显色5～10 min，水冲洗，复染，脱水透明后封片，镜检。以PBS代替一抗作为阴性对照。

    每份标本分别选取5个低倍镜（×10）视野，采用免疫组化分析软件（HPIAS-1000高清晰度彩色病理图文报告分析系统）进行免疫组化阳性表达分析，对选取视野内α-SMA免疫组化阳性信号进行图像分析，计算小管间质免疫组化检测阳性面积和小管间质总面积的比值，取5个比值的平均值作为每例患者肾小管间质区域α-SMA的阳性率（％）。

    1.5  血液检测指标  患者入院时检测血液流变学、血纤维蛋白原、血肌酐、血尿素氮等指标。

    1.6  统计学方法  应用SPSS 11.0对数据进行统计学分析，数值以x±s表示，采用单因素方差分析以及直线相关分析方法。

    2  结  果

    2.1  血瘀指数与肾间质纤维化程度的相关关系  轻度、中度和重度损伤组患者的血瘀指数分别为3.14±0.56、4.87±0.89、6.63±0.86；随着肾间质纤维化的程度逐渐增加，血瘀指数显著增加（P＜0.05）。见表1和图1。肾间质纤维化程度与血瘀指数呈正相关（r＝0.889，P＜0.05）。

    2.2  α-SMA在肾络瘀阻患者肾间质内的表达以及相关关系  轻度损伤组α-SMA在病变间质中散在表达，其中包括间质细胞和部分肾小管上皮细胞；中度和重度组α-SMA的表达显著增加（P＜0.05）。中到重度病变组患者的肾小球内也可见α-SMA表达，主要出现在系膜区。见表1和图2。相关分析显示，血瘀指数与α-SMA在肾间质内的表达水平呈正相关（r＝0.68，P＜0.05）。

    2.3  血瘀指数与肾功能的相关关系  血瘀指数与血肌酐、血尿素氮呈负相关（P＜0.05），相关性r值分别为－0.623和－0.685。表 1  各组患者的血瘀指数、肾间质α-SMA表达以及血肌酐和血尿素氮含量（略）

    3  讨  论

    正常肾间质中的主要细胞类型是成纤维细胞、血管周细胞和单核巨噬细胞，并没有MFB。MFB兼有平滑肌细胞和成纤维细胞的特点，既具有收缩功能，又能产生胶原和ECM成分。作为活化的成纤维细胞，MFB主要表达α-SMA。研究表明一旦受到缺血、缺氧和炎症等刺激，平时处于静息状态的肾间质成纤维细胞就会发生功能和表型改变，转变为表达α-SMA的MFB，而MFB合成ECM的能力显著增强［1］。ECM持续大量在肾间质中沉积，最终导致肾间质纤维化、肾脏结构破坏和功能损伤。除此以外，间质中肾小管上皮细胞和血管平滑肌细胞受到刺激发生活化，也可以转分化为MFB。

    根据过程中的临床表现及发病特点，肾间质纤维化属中医水肿、癃闭、关格、肾劳、溺毒、尿血等病证范畴。中医学认为本病属本虚标实之证，本虚主要是肺、胃、脾、肾虚，其中尤以脾肾虚为主；标实则以湿浊、湿热、瘀血、湿毒为主。其中血瘀又常常是导致该病加重和恶化的直接原因，研究证实活血化瘀药物具有减轻肾间质纤维化的作用，在一定程度上改善肾功能［3-5］，从辨证求因的角度反证了这种肾络瘀阻证的存在。

    我们在实验中发现，肾络瘀阻证患者血瘀指数随着间质纤维化程度增加而加重，并且与间质中α-SMA的表达量呈正相关（P＜0.05），这说明血瘀作为致病原因之一，参与了肾间质纤维化的发生、发展过程，并与表达α-SMA的MFB密切相关。我们还发现肾络瘀阻患者血瘀程度与肾功能指标血肌酐、血尿素氮的水平呈负相关（P＜0.05），随着血瘀程度的加深，患者肾脏功能逐渐下降，甚至衰竭。中医认为慢性肾病病程日久，脏器虚损，气化障碍，则导致气滞血瘀、气虚血瘀。“气结则血凝”、“气结则血滞”，随着纤维化程度的加重，慢性肾病患者多有血瘀证的表现，且随着病程日久，病情加重，血瘀证亦加重。以往研究发现，活血化瘀药能够抑制成纤维细胞增殖，并抑制肾小管上皮细胞转分化，而我们的实验也在验证了肾络瘀阻证与成纤维细胞和肾小管上皮细胞活化、转分化呈正相关的基础上，为使用活血化瘀治则、抑制肾间质纤维化，抑制MFB的增殖提供了实验基础和理论依据。

【】
  1 Li C. Organ fibrosis: foundation and clinic. Beijing: People’s Medical Publishing House. 2003: 113-114. Chinese.

李才. 器官纤维化: 基础与临床. 北京: 人民卫生出版社. 2003: 113-114.

2 China Society of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine. Diagnostic criteria for syndrome of blood stasis. Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 1987; 7(3): 129. Chinese.

中西医结合研究会. 血瘀证诊断标准. 中西医结合杂志. 1987; 7(3): 129.

3 Ning YY, Wang JQ, Qu SL. Effect of emodin on human kidney fibroblast proliferation. Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 2000; 20(2): 105-106. Chinese with abstract in English.

宁英远, 王俭勤, 屈遂林. 大黄素对人肾成纤维细胞增殖的影响. 中西医结合杂志. 2000; 20(2): 105-106.

4 Gao JY, Shi ZS. Study of Dahuang Zhechong Pill in treating the rats with chronic renal function failure. Zhongguo Zhong Yi Yao Ke Ji. 1998; 5(2): 73-74. Chinese.

高峻钰, 时振声. 大黄庶 虫虫丸治疗大鼠慢性肾功能衰竭的实验研究. 中国中医药科技. 1998; 5(2): 73-74.

5 Hu HX, Liu ZM, Cai Q, et al. Effect of Yishen Huoxue Xiezhuo method on TGF-β in the nephridial tissue of the rats with renal function failure. Zhongguo Zhong Yi Ji Chu Yi Xue Za Zhi. 2000; 6(6): 369-371. Chinese.