蒺藜皂苷对缺氧-复氧诱导大鼠皮层神经元凋亡的影响

                          作者：刘雪梅, 黄启福 张允岭, 娄金丽, 柳洪胜, 郑宏

【关键词】  蒺藜; 神经元; 细胞凋亡; 线粒体; 缺氧

    Objective: To observe the effects of Tribulus terrestris L. saponion (TTLS) on apoptosis in cortical neurons induced by hypoxia-reoxygenation in rats.

    Methods: Primary culture of rat cortical neurons was performed in vitro. A model of apoptosis of cortical neurons was established by hypoxia and reoxygenation. Hypoxia for 3 h in neural cells was induced with mixture of 95% N2 and 5% CO2, and then reoxygenation in neural cells was induced with mixture of 95% O2 and 5% CO2 for 12 h. Different concentrations of TTLS were administered to traditional Chinese herbal medicine-treated group separately during hypoxia and reoxygenation. The apoptosis rate was analyzed quantitatively by flow cytometry with Annexin V-FITC and propidium iodide staining. Mitochondria membrane potential was observed by a confocal laser-scanning microscope with JC-1 fluorescence. Caspase-3/7 activity in cytoplasm was measured by fluorescent plate reader. Bax protein expression was observed by immunohistochemical technique.

    Results: The percentage of apoptosis was significantly increased, mitochondria membrane potential was obviously decreased, fluorescence of caspase-3/7 activity was increased, and Bax protein was abundantly expressed followed by 3 h of hypoxia and 12 h of reoxygenation (P<0.01). TTLS could inhibit the depression of membrane potential induced by hypoxia and reoxygenation, decrease the activity of caspase-3/7, reduce the expression of Bax protein, and inhibit the apoptosis of the cortical neurons.

    Conclusion: Hypoxia and reoxygenation can induce apoptosis of rat cortical neurons. TTLS can decrease the apoptosis induced by hypoxia and reoxygenation. The mechanism might be related to stabilization of mitochondria membrane potential, inhibition of caspase activity and reduction of Bax protein expression.

    Keywords: Tribulus terrestris; neurons; apoptosis; mitochondria; anoxia

    蒺藜皂苷(Tribulus terrestris L. saponion, TTLS)是从吉林产蒺藜地上全草中提制,主要包括呋甾醇和螺甾醇两类皂苷。大量研究证实TTLS具有增加脑血流量，减轻脑含水量，减少脑梗死面积等作用［1-3］。前期研究证实心脑舒通胶囊(主要成份为TTLS)对大鼠急性多发性脑梗死脑缺血病变有明显的改善作用［4］，并且TTLS可抑制皮层神经元凋亡的发生。本实验在对原代培养的大鼠大脑皮层神经元缺氧缺糖后，进行给氧给糖处理,观察TTLS对皮层神经元凋亡以及线粒体膜电位变化的影响,从凋亡机制上进一步探讨TTLS对缺氧-复氧后大鼠皮层神经元凋亡的影响。

    1  材料和方法

    1.1  主要药品与试剂  TTLS冻干粉由吉林省敖东洮南药业股份有限公司提供；高糖达尔伯克改良伊格尔（Dulbecco’s modified Eagle’s medium, DMEM）培养基、Neurobasal Medium、B27 supplement购自Gibco公司；胎牛血清、马血清购自Hyclone公司；胰蛋白酶、多聚赖氨酸（MW 1.5×105～3.0×105）、JC-1购自Sigma公司；AnnexinⅤ-FITC/碘化丙啶（propidium iodide, PI）凋亡检测试剂盒购自北京宝赛生物技术有限公司； Apo-ONE Homogeneous Caspase-3/7 Assay购自Promega；Bax鼠单克隆抗体、即用型快速免疫组化MaxVisionTM试剂盒、浓缩型二氨基联苯胺（diaminobenzidine, DAB）试剂盒购自福州迈新生物技术开发有限公司。

    1.2  主要仪器  CO2培养箱（SHEL-LAB 2323）；低温高速多功能离心机（Eppendorf 5415D）；荧光酶标仪（BIO-TEK FLx800）；激光扫描共聚焦显微镜（Olympus FV500-IX81）；流式细胞仪（Beckman Coulter Epics Altra）。

    1.3  皮层神经元的原代培养  ［5，6］对皮层神经元进行原代培养。取出生12 h以内Wistar大鼠（雌雄兼用，由医学院实验动物中心提供）。无菌条件下取出全脑，在解剖显微镜下剥离脑膜，分离出大脑皮层，将其剪成约1 mm3大小组织块，用终浓度为0.125％胰蛋白酶溶液37 ℃消化30 min。含10％胎牛血清和10％马血清的高糖DMEM中止消化2次，细口径吸管反复轻轻吹打成均匀的细胞悬液。200目筛网过滤，收集过滤后的单细胞悬液，接种于预先经0.01%多聚赖氨酸浸泡的无菌塑料培养板中。细胞于37 ℃、5% CO2培孵箱中培养。24 h待细胞贴壁后，换无血清培养液（98％ Neurobasal medium＋2％ B27），以后每3 d换无血清培养液1次（换半液）。培养7～8 d的神经细胞用于实验。

    1.4  模型制备和实验分组  取培养7～8 d的神经细胞，吸除原培养液，加入无糖Earle’s液，置于缺氧盒中，通入95% N2和5% CO2的混合气体30 min（流量1.5 L/min），随后密闭缺氧盒，置37 ℃、5% CO2的培养箱中孵育3 h，在此基础上，再换成正常培养液（作为复氧液）继续放入37 ℃、5% CO2的培养箱中孵育12 h，制备为缺氧-复氧模型。

    实验分为正常对照组，用正常培养液孵育，不缺氧；模型组；TTLS组，缺氧液和复氧液中均加入TTLS，余同模型组。

    1.5  检测指标

    1.5.1  TTLS对皮层神经元活力的影响  取0.2 g TTLS冻干粉溶于低糖DMEM培养基10 ml中（避光），过滤灭菌，得TTLS贮液，浓度为20 g/L。用时将TTLS贮液按倍比稀释成相应浓度。细胞接种于96孔培养板内，生长至第7天，随机分为7组：对照组，模型组，0.003 g/L、0.006 g/L、0.012 g/L、0.025 g/L和0.050 g/L TTLS组。缺氧液与复氧液均加入不同浓度TTLS。造模时间结束后，每孔加入5 g/L甲基噻唑基四唑（methyl thiazolyl tetrazolium, MTT）工作液20 μl，37 ℃继续孵育4 h，翻板法弃去孔内培养液，每孔加入150 μl二甲亚砜（DMSO），振荡10 min，使甲臜充分溶解，酶标仪490 nm波长处，以空白孔调零，读取各孔吸光度（optical density, OD）。OD值代表细胞活性值。

    1.5.2  流式细胞仪检测皮层神经元凋亡率  各组细胞，0.125%胰酶消化、离心制成细胞悬液，加入10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，室温下避光共染60 min，200目筛网过滤。在流式细胞仪上用LOG软件分析，绘制神经细胞凋亡率的平均荧光值分布图。

    1.5.3  激光扫描共聚焦显微镜检测线粒体膜电位  细胞用直径35 mm Petri皿培养，用终浓度5 μmol/L JC-1 37 ℃孵育30 min，PBS溶液洗3遍，洗去残留的荧光染料。激光扫描共聚焦显微镜观察。激发光为488 nm，分别在527 nm和590 nm处采集发射光的荧光强度。

    1.5.4  荧光酶标仪检测caspase-3/7的活性  具体操作按照试剂盒说明书进行。将荧光底物与缓冲液按1∶100混合配成反应试剂，加入与培养细胞上清液等量的反应试剂，300～500 r/min震荡45 s，室温避光反应1 h，荧光酶标仪检测各孔荧光强度，激发光为（480±10）nm，发射光为（528±10）nm。

    1.5.5  免疫细胞化学法检测Bax蛋白表达  取各组神经元。（1）弃去培养液，PBS洗3 min×3次，4％多聚甲醛室温固定30 min，PBS洗3 min×3次；（2）3％ H2O2去离子水室温孵育30 min，阻断内源性过氧化物酶，蒸馏水洗3次；（3）滴加Bax一抗（1∶100）4 ℃过夜；PBS洗3 min×3次；（4）滴加即用型MaxVisionTM试剂，室温孵育15 min，PBS洗3 min×3次；（6）DAB显色，使用DAB显色试剂盒。室温显色，镜下控制反应时间，一般在5～10 min之间。蒸馏水洗涤。常规脱水、透明、封片。

    结果采用IPP显微图像分析系统，每例标本随机选取5个视野，高倍镜下检测阳性神经细胞Bax的表达。

    1.6  统计学方法  实验数据以x±s来表示。应用SPSS软件作统计分析，组间均数比较采用单因素方差分析，并作独立样本的t检验。

    2  结  果

    2.1  TTLS对缺氧-复氧损伤后皮层神经元活力的影响  预实验中观察到缺氧3 h复氧不同时间对皮层神经元有损伤，在缺氧3 h复氧12 h时损伤明显，因此，本实验选用缺氧3 h复氧12 h作为诱导皮层神经元凋亡的时间。

    MTT结果显示，模型组细胞活性明显低于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；与模型组比较，0.003 g/L的TTLS对神经细胞活力无改善作用，随着TTLS浓度增大，神经细胞的活力也逐渐升高，差异有统计学意义。其中0.025 g/L与0.05 g/L的TTLS对细胞活力改善尤为明显（P<0.01），二者之间比较，差异无统计学意义。由于药物浓度过大对细胞也有一定的损伤作用，因此本实验选用TTLS浓度为0.025 g/L作为药物干预的浓度。见表1。表1  TTLS对缺氧-复氧损伤后皮层神经元活力的影响（略）

    2.2  流式细胞仪检测神经元凋亡率的变化  流式细胞仪收集细胞得到的散点图中，Annexin V-FITC和PI双标记的区域，即第4象限，代表早期凋亡细胞。结果显示，当缺氧3 h复氧12 h后，凋亡细胞比例明显多于正常组（P<0.01）；0.025 g/L TTLS后，细胞凋亡率明显降低于模型组，差异有统计学意义（P<0.01）。提示缺氧3 h复氧12 h会导致皮层神经元损伤，损伤以早期凋亡为主，TTLS可以通过抑制细胞凋亡发挥作用。见表2和图1。表2  TTLS对缺氧-复氧损伤后皮层神经元凋亡率的影响（略）

    2.3  激光扫描共聚焦显微镜观察线粒体膜电位的改变  采用JC-1荧光标记检测神经细胞内线粒体膜电位，其在低膜电位下发绿色荧光（发射峰527 nm），在较高电位时形成J-聚集体，发红色荧光（发射峰590 nm），分别测定每个细胞在第1通道（绿色）和第2通道（红色）的荧光强度，用红/绿荧光强度的比值反映细胞膜电位变化趋势。采用Fluoview Version 4.3软件采集分析图像。每组随机取10个细胞，以每个细胞得到的15个荧光强度值的均值为此细胞的膜电位的平均荧光强度值。正常神经细胞红、绿色荧光均明显，线粒体膜电位较高，缺氧3 h复氧12 h后，绿色荧光明显，红色荧光非常低弱，线粒体膜电位下降明显，与正常组比较差异有统计学意义（P<0.01）；0.025 g/L TTLS治疗组神经细胞的红色荧光明显增强，线粒体膜电位明显升高（P<0.01）。见图2和图3。（略）

    2.4  荧光酶标仪检测caspase-3/7酶活性  当皮层神经元遭受缺氧3 h复氧12 h后，caspase-3/7酶的活性大量表达，明显高于对照组（P<0.01）。给予0.025 g/L TTLS治疗后，caspase-3/7酶的活性低于模型组，差异有统计学意义（P<0.01）。见表3。

    2.5  免疫细胞化学法观察Bax蛋白表达  免疫细胞实验表明,缺氧前神经元有少量Bax表达, Bax蛋白主要分布于神经元胞浆、突起及核膜上,呈棕黄色细小颗粒状,细胞核不着色。缺氧3 h复氧12 h后，神经元Bax表达增强，着色深。0.025 g/L TTLS治疗组Bax表达降低，着色变浅。见表4和图4。表3  TTLS对缺氧-复氧损伤后皮层 神经元caspase-3/7活性的影响（略）表4  TTLS对缺氧-复氧损伤后皮层神经元Bax蛋白表达的影响（略）

    3  讨  论

    缺血性脑卒中是临床上最常见的脑血管疾病之一，临床上给予再灌注治疗后非但没有减轻病情，反而加重脑损伤。脑缺血再灌注诱发的脑损伤主要是由于缺氧、兴奋性氨基酸、钙离子超载等各种因素引起的脑神经细胞发生凋亡或坏死［7］，其中凋亡是一个早期发生、动态持续、可逆转的异常过程，给予药物干预可能会逆转这一损伤过程。因此，我们采用体外培养皮层神经元，给予缺氧-复氧诱导神经细胞凋亡，应用Annexin V-FITC和PI双染法标记早期凋亡细胞，流式细胞仪检测早期细胞凋亡率，结果证实，缺氧3 h复氧12 h能明显诱导皮层神经元的大量凋亡，TTLS（0.025 g/L）可以减少神经元凋亡的发生。

    Susin等［8］认为线粒体是细胞早期凋亡的关键因素之一，在经典的凋亡信号出现之前，线粒体膜完整性已经开始改变，线粒体内、外膜的变化导致线粒体膜电位的崩解和各种凋亡诱导因子（如细胞色素C）的释放。因此，可以说线粒体膜电位的降低是凋亡级联反应中最先发生的重要标志之一［9］，它的降低标志着线粒体膜结构出现不可逆的改变，内膜通透性增高，进而外膜肿胀、破裂，最终导致线粒体内细胞色素C释放，是激活caspase酶的启动者和执行者，可诱导caspase介导的蛋白质变性、DNA降解，染色质凝聚，细胞凋亡。其中caspase-3是caspase级联反应下游最关键的凋亡蛋白酶，在各种因素启动的凋亡程序中起着最后的枢纽作用［10，11］。Bax是Bcl-2家族中最主要的促凋亡蛋白，在凋亡信号刺激下由细胞胞浆转运到线粒体膜上，引起线粒体膜通透性转变孔开放，促使线粒体释放细胞色素C，激活caspase酶，最终导致细胞凋亡［12］。因此我们通过检测线粒体膜电位、caspase-3活性和Bax蛋白表达，试图解释TTLS对缺氧-复氧诱导的皮层神经元凋亡的保护作用。

    蒺藜属蒺藜科植物（Tribulus terrestris L.），具有平肝解郁、活血祛风、明目、止痒之功效［13］。TTLS是从蒺藜地上全草中提取，为蒺藜草的主要有效成分，主要包括呋甾醇和螺甾醇两类皂苷，是以甾体皂苷为主的十多种皂苷的混合物。研究发现TTLS对脑动脉硬化症和脑血栓形成后遗症有较好的疗效，能增加脑缺血部位的血供，减轻脑含水量，减少脑梗死面积，改善脑循环，保护缺血脑组织［2，3，14］。以TTLS为主要成分制成的心脑舒通胶囊和心脑舒通片早已在临床上广泛使用，在心、脑血管疾病方面有着良好的疗效。本实验采用荧光探针JC-1的荧光强度来反映线粒体膜电位的高低，以caspase-3的活性以及Bax蛋白的表达来了解细胞凋亡时的功能变化。结果发现缺氧3 h复氧12 h可明显诱发细胞线粒体膜电位下降，caspase-3/7酶的活性显著增加，Bax蛋白有大量表达，而TTLS预处理可增加缺氧-复氧神经细胞线粒体膜电位而抑制caspase-3/7酶的活性，并降低Bax蛋白的表达，从而有效地发挥其抗凋亡作用。由此，我们得出缺氧-复氧诱导皮层神经元的凋亡，TTLS能减少缺氧-复氧后细胞凋亡的发生，其机制与维持线粒体膜电位的稳定，抑制caspase-3酶激活，降低Bax蛋白表达有关。

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