生存素在结肠癌中的表达及其临床病理意义
【摘要】 目的 探讨Survivin蛋白在结肠癌中的表达及其与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移、Dukes分期等各临床病理参数之间的关系。方法 应用免疫组织化学技术，检测43例结肠癌组织中Survivin蛋白的表达，并与同期15例结肠腺瘤与10例正常癌旁组织作对照。结果 结肠癌组织中Survivin的阳性表达率为62.79%，显著高于腺瘤组和正常癌旁黏膜组，差异有统计学意义(χ2分别=10.88、12.80， P均<0.05);Survivin的阳性表达与肿瘤的浸润深度、脉管侵犯及淋巴结转移呈正相关(χ2分别=4.46、7.57、6.66，P均<0.05)，与Dukes分期有关(χ2=5.59，P<0.05)，与患者性别、年龄、肿瘤大小、分化程度无明显关系。Survivin表达阴性和阳性患者的5年生存率比较，差异有统计学意义(χ2=5.08，P<0.05)。结论 Survivin在结肠癌组织中呈高表达，并参与结肠癌的侵袭与进展，可能是反映结肠癌生物学行为及判断其预后的重要生物学指标之一。
【关键词】 结肠肿瘤; 生存素; 预后
Abstract Objective To explore the expression patterns of survivin in tissue specimens of primary colon cancers and the association between the surviving expression and pathological characteristics of colon cancer. Methods Formalin-fixed paraffin-embedded samples from 43 colon cancer, 15 adenoma and 10 non-cancer mucosa were immunostained using polyclonal survivin. The degree of immunostaining was recorded according to the percentages of staining and distributions within the cytoplasm and nucleus. Results 62.79% of cancer samples were positive for surviving protein, while normal colon tissue was immunonegative. Statistical analysis revealed that survivin expression was correlated with invasive depth, vessel infiltration, lymph node metastasis(χ2=4.46, 7.57,6.66, P<0.05)and Dukes stage(χ2=5.59, P<0.05), but independent of gender, age, tumor size, and differentiation. The survival time had significant difference between survivin expression positive and negative patients(χ2=5.08，P<0.05).Conclusions Survivin is frequently overexpressed in primary colon carcinoma and could both be a useful diagnostic marker and a favorable prognostic indicator for colon cancer patients.
?眼Key words?演 colon carcinoma; survivin; prognosis Survivin属于抗细胞凋亡蛋白(inhibitor of apoptosis , IAPs) 家族,主要通过抑制细胞凋亡、促进新生血管形成而维持肿瘤细胞的生长并加速其侵袭。研究表明，Survivin在多种人类恶性肿瘤中有异常表达，在乳腺癌(65%)及其转移淋巴结(85%)中表达可逐级增加，与乳腺癌、肝癌、胰腺癌等肿瘤的组织学分级、放化疗敏感性以及各种预后不良的病理参数有关[1～3]。本次研究利用免疫组织化学技术对人结肠癌及癌前病变组织内Survivin的表达情况进行检测，以阐明它们在预测结肠癌组织学类型、生长方式、脉管浸润、分期和预后方面的临床病理意义。
1 材料与方法
1.1 一般资料 选取温岭市第一人民1999年8月至2003年8月间手术切除的结肠癌标本43例。患者年龄31～78岁之间，平均(57.83±6.70)岁，其中男性28人，女性15人。按Dukes分期标准: Dukes A、B期25例，Dukes C、D期18例。组织学分型：高分化腺癌12例、中分化腺癌17例，低分化腺癌14例。有脉管侵犯者25例、无脉管侵犯18例。另取同期结肠腺瘤15例及距癌边缘5cm以上的邻近无增生或不典型增生的非肿瘤结肠黏膜10例作为对照。均有5年以上完整随访资料,随访截止日期2008年11月，生存期的从手术日期到随访截止日期，或由于复发、转移而死亡的日期为止，截尾值为0。
1.2 方法
1.2.1 实验试剂 免疫组织化学试剂：兔抗人Survivin多克隆抗体(工作液)、SP试剂盒、DAB显色剂均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.2.2 免疫组化染色 链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶连接法(SP法)，操作按SP试剂盒说明书进行，主要包括石蜡切片、常规脱蜡至水、抗原修复、3%H2O2 阻断内源性过氧化物酶、山羊血清封闭、滴加一抗、二抗及链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物、DAB 显色、复染封片。用PBS代替一抗做阴性对照，用试剂盒中阳性片子做阳性对照。以胞质或胞核有棕黄色颗粒为阳性信号。
1.2.3 判断标准 Surviving 主要定位于肿瘤细胞质、伴有胞核着色，阳性细胞呈棕黄色染色。根据染色程度和染色细胞百分率进行评定和分析：基本不着色者0分，着色淡者1分，适中者2分，深者3分;着色细胞占计数细胞的百分率≤5%记为0分，6%~25%记1分，26%~50%记2分，≥51%记3分;将每张切片的染色程度与染色细胞百分率得分相乘，其乘积为最后得分。0~1分为阴性(-)，2~3分为弱阳性(+)，4~6分为中等阳性(++)，>6分为强阳性(+++)。
1.2.4 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。计数资料采用χ2检验或Fisher's确切概率法检验。生存数据采用Log-ank 检验差异。设 P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 Survivin在结肠癌组织、腺瘤与正常黏膜组织中的表达见表1
由表1可见，结肠癌组织中Survivin的阳性表达率显著高于腺瘤组和正常癌旁黏膜组，差异有统计学意义(χ2分别=10.88、12.80， P均<0.05)。
2.2 Survivin与结肠癌临床病理参数的关系见表2
由表2可见，Survivin的阳性表达与肿瘤的浸润深度、脉管侵犯及淋巴结转移呈正相关(χ2分别=4.46、7.57、6.66，P均<0.05)，与Dukes分期有关 (χ2=5.59，P<0.05)，与患者性别、年龄、肿瘤大小、分化程度无明显关系(χ2=2.56、0.28、0.83、0.14，P均>0.05)。
2.3 Survivin表达与预后的关系见表3
由表3可见，Survivin表达阴性和阳性患者的5年生存率比较，差异有统计学意义(χ2=5.08，P<0.05)。因此，Survivin蛋白的阳性表达可能与结肠癌预后不良有关。
3 讨论
结肠癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，其发生与细胞凋亡及异常增殖密切相关。Survivin通过上调转录因子特异性蛋白1(sp1)与Fas L启动子的结合，可增加结肠癌细胞的Fas配体的表达，而抑制其凋亡[4]。目前，不少学者对Survivin在结肠癌组织中的高表达情况进行了报道，但有关其在结肠癌发生发展中的临床病理意义，并没有一致的结论[5，6]。本次研究利用免疫组织化学技术对结肠癌标本中Survivin的蛋白表达进行检测，并与同期结肠腺瘤和邻近正常非肿瘤黏膜作对照。结果显示结肠癌黏膜多数呈Survivin阳性表达，与腺瘤及非肿瘤组织相比差异显著(P<0.05)，其中肿瘤侵及浆膜或浆膜外、有脉管侵犯或淋巴结转移者，Dukes C、D期的患者Survivin 阳性表达率明显升高(P<0.05);这与Alper等[7]报道的Survivin蛋白主要表达于结肠肿瘤细胞，尤其是炎症细胞高度浸润和血管增生密集区的观点相符。同时，Stanilov 等[8]在转录水平对癌组织Survivin mRNA检测也支持了这一论点。
生存分析表明，Survivin阴性患者的总体生存时间及5年生存率均高于阳性患者。结合Survivin在癌黏膜、腺瘤及正常黏膜的表达率递减现象，本次研究推测Survivin在结肠肿瘤中的表达可能是与肿瘤演变相一致的渐进过程，与结肠癌的侵袭及转移有关，并且可能是判断其预后的重要分子标志之一。近年来，许多研究尝试对Survivin表达或信号通路进行阻断，以观察其对肿瘤细胞的影响，如Sarthy等[9]利用SiRNA干扰K-Ras转化的结肠癌细胞的Survivin表达，发现Survivin基因的缺失将导致细胞周期的G2-M期停滞，使细胞转向死亡。因此，利用单克隆抗体、小分子抑制物、反义基因等抑制Survivin的表达或功能有可能发展为结肠癌靶向中的一种新方法。
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