冬虫夏草菌丝提取物降低二甲基亚硝胺大鼠肝硬化门静脉高压效应的组织学基础

              作者：王宪波, 刘平, 唐志鹏, 李风华, 刘成海, 胡义扬, 徐列明 

【摘要】  目的：探讨冬虫夏草菌丝提取物（Cordyceps mycelia extract, CME）对二甲基亚硝胺（dimethylnitrosamine，DMN）大鼠肝硬化门静脉高压的防治效应及其作用机制。方法：50只Wistar大鼠采用10 μg/kg DMN腹腔注射持续4周的方法制备大鼠肝硬化模型，并取15只大鼠作为正常对照组。造模即日起CME预防组大鼠(n=15)予0.74 g/(kg·d) CME灌胃(按冬虫夏草菌丝生药质量)，1次/d，预防用药持续4周；CME组大鼠(n=10)于造模成功后开始给药，用药4周。分别于造模后3 d、2周、4周和造膜终止后2周、4周进行动态效应观察，肠系膜前静脉分支插管法检测门静脉压力（pressure of portal vein，Ppv）；放射免疫法测定血清透明质酸（hyaluronic acid，HA）含量，免疫组织化学法检测肝窦壁CD44、第Ⅷ因子相关抗原血管假性血友病因子（von Willebrand factor, vWF）、α?平滑肌肌动蛋白（alpha?smooth muscle actin, α?SMA）、层黏连蛋白（laminin, LM）、Ⅳ型胶原（collagen type Ⅳ, Col Ⅳ）和Ⅰ型胶原（collagen type Ⅰ, ColⅠ）表达。结果：预防用药4周后，与模型组比较，CME组大鼠门静脉管径显著缩小，门静脉压力显著降低（P<0.05），血清HA含量显著下降（P<0.05），vWF、α?SMA、Col Ⅳ、LM、Col Ⅰ染色减弱（P<0.05），CD44染色增强（P<0.05）。治疗用药2周时，与模型组比较，CME组大鼠门静脉直径显著缩小，门静脉压力显著降低（P<0.05），血清HA含量显著下降（P<0.05）。治疗用药4周时CME组大鼠门静脉管径与门静脉压力恢复至同期正常对照组大鼠水平。治疗用药2、4周时，与模型组比较，CME组大鼠肝窦壁CD44染色面积增加（P<0.05），LM、α?SMA、vWF和Col Ⅰ染色减弱（P<0.05），肝窦壁Col Ⅳ染色无显著变化。结论：CME对DMN致大鼠肝硬化门静脉高压具有良好的干预和治疗作用。CME抗肝窦壁损伤、保护肝窦内皮细胞、抑制肝星状细胞活化，抑制肝窦毛细血管化形成与促进其逆转是其效应的组织学基础。

【关键词】  冬虫夏草菌丝提取物; 门静脉高压; 肝硬化; 肝窦内皮细胞; 大鼠

    Objective: To study the effects of Cordyceps mycelia extract (CME) on portal hypertension in rats with dimethylnitrosamine (DMN) induced liver cirrhosis and probe into the mechanism of the action.

    Methods: A rat model of liver cirrhosis was induced by peritoneal injection of DMN (at a dose of 10 μg/kg, once a day, 3 consecutive days per week) for 4 weeks. Other 15 rats were assigned into normal control group. The rats in CME?prevented group were administrated CME 0.74 g/(kg·d), once a day, simultaneously with DMN treatment and kept on 4?week administrating, and the rats in CME?treated group were administrated after the model was established. After 3?day, 2? and 4?week DMN injection and 2?, 4?week after the rat liver got cirrhosis, the pressure of portal vein (Ppv) was directly measured by intubation via tributary of vena mesenterica anterior. The serum hyaluronic acid (HA) content was measured by radioimmunoassay. The expressions of CD44, von Willebrand factor (vWF), laminin (LM), alpha?smooth muscle actin (α?SMA), type Ⅰ collagen (Col Ⅰ) and type Ⅳ collagen (Col Ⅳ) proteins in the hepatic sinusoidal walls were examined by immunohistochemistry.

    Results: The caliber of portal vein (Cpv) and Ppv in the CEM group (after 4?week prevention) were significantly decreased as compared with those in the untreated group at the same point of time (P<0.05), also including serum HA content (P<0.05), and vWF, Col Ⅰ, Col Ⅳ, LM, α?SMA positive staining (P<0.05); however, CD44 positive staining were increased in the CEM group (P<0.05). The Cpv, Ppv and serum HA content were significantly decreased after 2?week CME treatment as compared with those in the untreated group (P<0.05). After 4?week CME treatment, the Cpv and Ppv in the CEM group were recovered to the normal level. After 2? and 4?week CME treatment, vWF, Col Ⅰ, LM and α?SMA positive stainings were decreased (P<0.05), and CD44 positive staining was increased (P<0.05) in the CME group as compared with those in the untreated group at the same point of time, but there were no marked changes found in Col Ⅳ staining.

    Conclusion: CME plays a good role in preventing and treating the portal hypertension in rats with DMN?induced liver cirrhosis. The histological bases of the effects are to treat liver sinusoidal endothelial cell injury, inhibit hepatic stellate cell activation, inhibit and reverse hepatic sinusoida1 capillarization.

    Keywords: Cordyceps mycelia extract; portal hypertension; liver cirrhosis; liver sinusoidal endothelial cells; rat

    门静脉高压是肝硬化常见的病理表现，也是影响肝硬化患者预后的重要因素，积极寻找治疗肝硬化门静脉高压的药物和方法具有重要的医学价值和社会意义。二甲基亚硝胺（dimethylnitrosamine, DMN)诱导的大鼠肝纤维化动物模型具有类似人类肝纤维化和肝硬化的病理特征，常用于肝纤维化和肝硬化门静脉高压的发病机制研究和药物干预研究［1?5］。冬虫夏草菌丝（Cordyceps mycelia）具有抗肝纤维化作用［6］，但尚未见到有关其治疗肝硬化门静脉高压的研究报道。本研究旨在探讨冬虫夏草菌丝提取物（Cordyceps mycelia extract, CME）对DMN大鼠门静脉高压的干预和治疗作用，并对其作用机制进行探讨，以期为临床应用提供研究基础。

    1  材料与方法

    1.1  实验材料

    1.1.1  实验动物  65只Wistar雄性大鼠，清洁级，体质量（150±10）g，院上海实验动物中心提供。

    1.1.2  主要试剂和仪器  DMN，东京化成株式会社产品；冬虫夏草菌丝，江西国药责任有限公司产品。透明质酸（hyaluronic acid，HA）检测试剂盒，上海海军医学研究所产品；兔抗人CD44多克隆抗体，武汉博士德生物公司产品；兔抗人第Ⅷ因子相关抗原血管假性血友病因子（von Willebrand factor, vWF）多克隆即用型抗体，DAKO公司产品，上海中达医学应用研究所提供；兔抗鼠层黏连蛋白（laminin，LM）多克隆抗体，SIGMA公司产品；鼠抗人α?平滑肌肌动蛋白（α?smooth muscle actin, α?SMA）单克隆抗体，DAKO公司产品；兔抗鼠Ⅰ型胶原(collagen type Ⅰ，Col Ⅰ)、Ⅳ型胶原(collagen type Ⅳ, Col Ⅳ)抗血清，复旦大学上海医学院病理教研室产品，工作浓度1∶100。Power Lab生理数据处理和分析系统，澳大利亚ADI公司产品；HPIAS?1000高清晰度彩色病理图文分析系统，武汉同济医科大学千屏影像工程公司产品。

    1.2  实验方法

    1.2.1  冬虫夏草菌丝提取物的制备  冬虫夏草菌丝用70%乙醇回流提取6次，3 h/次，合并回流提取液，回收乙醇；流浸膏加水混匀，用石油醚反复萃取至萃取液颜色变为淡棕色，回收石油醚；提取物浓缩干燥至粉末状。由中国科学院上海药物研究所制备。

    1.2.2  模型制备和分组  Wistar大鼠65只，饲养于清洁级动物房。其中50只大鼠用于肝硬化模型制备，以DMN 10 μg/kg剂量作腹腔内注射，1次/d，每周连续3 d、共4周［7］。15只正常大鼠给予等剂量生理盐水腹腔注射，设为正常对照组。

    自造模之日起，从造模大鼠中采用随机数字表方法随机取15只大鼠给予CME干预，设为CME预防组，按冬虫夏草菌丝原药材0.74 g/kg（冬虫夏草菌丝原药材临床成人用量6 g/d，按65 kg体质量成人的8倍量计算）灌胃，1次/d；于给药后3 d、2周、4周3个观察点分别取模型组与CME预防组大鼠各5只以及正常对照大鼠3只，对门静脉压力及其相关生化、肝组织学指标作动态观察。

    造模4周后大鼠肝硬化模型形成，20只大鼠随机分为模型组和CME治疗组。CME治疗组大鼠给予CME灌胃，0.74 g/kg，1次/d，共4周；正常对照组大鼠给予与药物等量的生理盐水灌胃。于给药后2周和4周，分别取模型组与CME组5只，同期正常对照组大鼠3只，检测门静脉压力后，经下腔静脉采血并获取肝组织。

    1.2.3  观察指标

    1.2.3.1  门静脉直径及压力的测定  大鼠用2%戊巴比妥钠（2 ml/kg体质量）腹腔注射麻醉后，仰卧位固定，打开腹腔，暴露门静脉主干，用游标卡尺测量距肝门0.5 cm处的门静脉直径；于肠系膜前静脉右侧靠近门静脉处分离出一回肠肠系膜静脉分支，结扎其远端，然后用血管剪剪开一适宜缺口，将PE?100导管自缺口插入后，沿肠系膜前静脉上行，通过脾静脉至门静脉主干，固定导管并接通压力换能器，经Power Lab生理数据处理和分析系统获得门静脉压力数据。

    1.2.3.2  血清透明质酸含量测定  血清透明质酸测定采用放射免疫法，具体操作按试剂盒说明书进行。

    1.2.3.3  CD44、vWF、α?SMA、LM、Col Ⅳ和Col表达测定  免疫组化染色法检测CD44、vWF、α?SMA、LM、Col Ⅳ和Col Ⅰ表达。取肝脏组织，石蜡切片，常规脱蜡至水，0.3% H2O2?甲醇，室温10 min，沸水浴20 min，0.1%胰蛋白酶37 ℃消化30 min，加入第一抗体，4 ℃过夜，加入兔抗人第二抗体，37 ℃ 30 min，二氨基联苯胺显色5 min，水洗、烘干、封片。PBS（pH 7.4）作空白对照染色。

    图像定量分析：每组各取3只大鼠肝脏免疫组化染色切片，在每张组织片随机选择5个不同视野，在200倍光学显微镜下，测定标准测量窗口（一个视野）中肝窦壁阳性区域的面积比。

    1.3  统计学方法  采用SPSS 10.0统计软件进行统计分析，计量资料数据用x±s表示，进行单因素方差分析，并用LSD?t检验进行两两比较；门静脉压力与各指标的相关分析用直线回归模型Regression进行相关性检验。检验水准为α=0.05。

    2  结  果

    2.1  门静脉直径和门静脉压力变化  与同期正常对照组比较，DMN造模2周后，模型组大鼠门静脉直径有增宽趋势，但差异无统计学意义（P>0.05）；4周和终止造模后2周（6周）后显著增宽（P<0.05）；8周后大鼠肝门静脉直径仍比正常对照宽，但差异无统计学意义（P>0.05）。模型组大鼠门静脉压力在造模2周后显著高于同期正常对照组（P<0.05），4周时门静脉压力达峰值；与4周时的模型组比较，终止造模后2周（6周后），门静脉压力降低（P<0.05），但仍显著高于同期正常对照组(P<0.05)，终止造模后4周（8周）后仍高于同期正常对照组大鼠，但差异无统计学意义(P>0.05)。与同期模型组比较，CME干预用药2周时门静脉直径与门静脉压力差异均无统计学意义（P>0.05）；干预用药4周时门静脉直径显著缩小、门静脉压力显著降低（P<0.05）。治疗用药2周时门静脉直径显著减小、门静脉压力显著降低（P<0.05）；治疗用药4周时门静脉直径与门静脉压力有所缩小或降低，但差异无统计学意义（P>0.05）。与正常对照组比较，CME预防用药2周时门静脉直径增宽（P<0.05），而2周和4周时门静脉压力均高于正常对照组（P<0.05）；CME治疗2周和4周时与正常对照组比较，门静脉直径和门静脉压力差异无统计学意义（P>0.05）。见表1和表2。 表1  各组大鼠门静脉直径的变化 表2  各组大鼠门静脉压力的变化

    2.2  血清HA含量变化  DMN造模3 d后与正常对照组比较，模型组和CME组大鼠血清HA含量急剧增高（P<0.05）。造模2周后较3 d时下降（P<0.05），4周时再次增高至3 d时水平；终止造模因素后2周（第6周）较4周时显著下降（P<0.05），第8周时进一步下降（P<0.05）；与同期模型组比较，CME预防用药2周时，大鼠血清HA含量有所降低，但差异无统计学意义（P＞0.05），预防用药4周时显著下降（P<0.05）；治疗用药2周时下降更明显（P<0.05），治疗用药4周时降至正常对照组大鼠的水平，但与同期模型对照组之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。与正常对照组比较，CME预防用药3 d、4周和治疗用药2周时，大鼠血清HA水平仍显著增高（P<0.05）。见表3。表3  各组大鼠血清HA含量变化

    2.3  肝窦壁CD44、vWF、α?SMA、Col Ⅰ、Col Ⅳ及LM变化

    2.3.1  肝窦壁CD44变化  与正常对照组大鼠相比，DMN造模3 d、2周、4周和终止造膜后第2周（6周）、第4周（8周）后大鼠肝窦壁CD44表达显著减少（P<0.05）。与同期模型组比较，CME组大鼠肝窦壁CD44表达于CME预防用药3 d时差异无统计学意义；但预防用药2周和4周以及治疗用药2周和4周时其阳性染色均显著增强（P<0.05）。CME预防用药3 d、2周、4周和治疗用药2周、4周时大鼠肝窦壁CD44表达仍明显弱于正常对照组（P<0.05）。见图1。

    2.3.2  肝窦壁vWF变化  与正常对照组大鼠比较，DMN造模3 d、2周、4周后肝窦壁vWF表达显著增加，4周时达峰值，终止造模后渐趋减轻，但6周、8周时肝窦壁vWF表达仍显著异常（P<0.05）。与同期模型组比较，预防用药3 d时大鼠肝窦壁vWF染色无显著差异，预防用药2周、4周以及治疗用药2周、4周时vWF阳性染色均显著减弱（P<0.05）。CME预防用药3 d、2周、4周和治疗用药2周、4周时大鼠肝窦壁vWF表达仍明显强于正常对照组（P<0.05）。见图2。

    2.3.3  肝窦壁α?SMA变化  与正常对照组大鼠比较，DMN造模3 d、2周、4周后肝窦壁α?SMA表达显著增加，4周时达峰值，终止造模后渐趋减轻，但6周、8周时肝窦壁α?SMA表达仍显著异常（P<0.05）。与同期模型组比较，3 d时预防组肝窦壁α?SMA染色无明显差异，预防用药2周、4周以及治疗用药2周、4周时肝窦壁α?SMA阳性染色均显著减弱（P<0.05）。CME预防用药3 d、2周、4周和治疗用药2周、4周时大鼠肝窦壁vWF表达仍明显强于正常对照组（P<0.05）。见图3。

    2.3.4  肝窦壁LM变化  与正常对照组大鼠比较，DMN造模3 d、2周、4周后肝窦壁LM表达显著增加，4周时达峰值，终止造模后渐趋减轻，但6周、8周时肝窦壁LM表达仍显著异常（P<0.05）。与同期模型组比较，3 d时预防组肝窦壁LM染色无明显差异，预防用药2周、4周以及治疗用药2周、4周时肝窦壁LM阳性染色均显著减弱（P<0.05）。CME预防用药3 d、2周、4周和治疗用药2周、4周时大鼠肝窦壁LM表达仍明显强于正常对照组（P<0.05）。见图4。图3  各组大鼠肝窦壁α?SMA表达的变化

    2.3.5  肝窦壁Col Ⅰ变化  与正常对照组大鼠比较，DMN造模3 d、2周、4周后肝窦壁Col Ⅰ表达显著增加，4周时达峰值，终止造模后渐趋减轻，但6周、8周时肝窦壁Col Ⅰ表达仍显著异常（P<0.05）。与同期模型组比较，3 d时预防组肝窦壁Col Ⅰ染色无明显差异，预防用药2周、4周以及用药2周、4周时肝窦壁Col Ⅰ阳性染色均显著减弱（P<0.05）。CME预防用药2周、4周和治疗用药2周、4周时大鼠肝窦壁Col Ⅰ表达仍明显强于正常对照组（P<0.05）。见图5。

    2.3.6  肝窦壁Col Ⅳ变化  与正常对照组大鼠相比，肝窦壁Col Ⅳ则在DMN造模3 d、2周均显著减少，4周、6周时显著增加（P<0.05）。与同期模型组比较，CME预防用药3 d时预防组肝窦壁Col Ⅳ染色增强（P<0.05），2周时两组无明显差异，预防用药4周时肝窦壁Col Ⅳ染色显著弱于模型对照组（P<0.05）；治疗用药2周、4周时与同期模型对照组间均无显著性差异（P＞0.05）。CME预防用药3 d、2周时肝窦壁Col Ⅳ表达弱于正常对照组大鼠（P<0.05），CME治疗用药2周时肝窦壁Col Ⅳ表达较正常对照组大鼠增强（P<0.05），而预防用药4周和治疗用药4周时两组之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见图6。

    2.4  门静脉压力与观测指标的相关性  以各指标动态观察时间点的均值作相关分析，其结果显示，门静脉压力与门静脉直径呈正相关，r=0.809（P<0.05）；门静脉压力与肝窦壁α?SMA、LM、vWF及HA含量呈正相关，r值分别为0.921、0.901、0.893和0.827（P<0.05）；门静脉压力与肝窦壁CD44和Col Ⅰ、Col Ⅳ无关，r值分别为－0.626、0.385、0.405（P＞0.05）。

    3  讨  论

    肝硬化是门静脉高压最常见的原因。传统上认为肝硬化时，纤维化和再生结节压迫血管，导致血管扭曲，从而使肝窦和终末门静脉阻力增加。但近年来研究认为，许多潜在性的可逆性因素起主要作用，包括肝窦壁细胞的收缩性，血管活性物质（如内皮素、一氧化氮）的产生及影响内脏小动脉的各种全身性神经体液因子等，肝细胞肿胀也促成门静脉高压。其中肝窦的血流障碍在肝硬化门静脉高压形成中的作用越来越受到重视［8?11］。

    早期形成门静脉压增高是DMN肝硬化大鼠模型的一个重要特征［12］。本文实验结果显示，在采用DMN腹腔注射3次的2周后门静脉压力即显著增高，造模4周后的门静脉压力均值为同期正常对照组大鼠的2.2倍，其门静脉管径呈同步增大；在终止DMN刺激后随着时间的推移而趋向逆转，终止DMN刺激2周后仍显著高于同期正常对照组大鼠，第8周的均值较同期正常对照组大鼠增高28％。表明DMN所致的慢性肝损伤大鼠门静脉压增高先于肝硬化的形成，终止造模因素刺激后门静脉压的缓解快于肝纤维化的消解。提示肝纤维结缔组织沉积并不是DMN肝硬化门静脉压增高的关键因素，肝窦壁的破坏及其结构的改变可能是重要原因之一。

    肝窦主要由肝窦内皮细胞（sinusoidal endothelial cells, SECs）组成，SECs远侧胞浆部分有发达的窗孔，其窗孔无隔膜，细胞膜表面有高度敏感和特异性透明质酸受体CD44［13］，这与血管内皮细胞表达特异性标志物vWF呈鲜明的差别［14］。内皮下无基底膜存在，但分布有特殊构型的Col Ⅳ及少量的LM，在面向肝细胞一侧Disse腔中附着有肝星状细胞（hepatic stellate cells, HSCs）。肝窦这一独特生态环境及结构是保证血液和肝细胞间正常物质交换以及保持门静脉压较为稳定的组织学基础。

    免疫组化观察结果显示，在造模3 d后，肝窦壁CD44、Col Ⅳ表达显著减少，vWF、α?SMA及LM表达显著增加，血清HA含量急剧增高；其中Col Ⅳ表达显著减少与血清HA含量的急剧增高充分显示出肝窦壁损伤是DMN肝损伤的早期事件，此后，除Col Ⅳ表现为2周前减少、4周增加外，其他指标均随着给予DMN造模时间的推进而呈进行性减少或增加，在终止造模因素刺激后则有所缓解。表明DMN的毒性作用可破坏正常的肝窦壁结构，导致肝窦内皮细胞向血管内皮细胞的转化，由于SECs表达的CD44减少，使SECs清除循环中HA的功能降低，导致血清HA水平升高，HA浓度高低是评价SECs功能的重要指标 ［5, 13, 15］。α?SMA既是肝星状细胞活化标志，也是反映肝星状细胞收缩力的的指标。活化的肝星状细胞分泌Ⅳ型胶原和Ⅰ型胶原以及LM等细胞外基质，由于α?SMA表达量增加而收缩力也增强，促使肝窦直径变窄，以致肝窦血流阻力增加，进而引起门静脉压力的增高［9, 10］。动态观察模型大鼠各时间点门静脉压力与各指标的相关性分析结果充分显示出肝窦壁病变在门静脉高压形成中的作用（门静脉压力与肝窦壁α?SMA、LM、vWF、血清HA含量等均呈显著的正相关关系，r值依次为0.921、0.901、0.893与0.827）。

    在DMN造模的同时，持续给模型大鼠CME干预，2周时门静脉压略有下降， 4周时较同期模型组显著降低；在4周造模成型并终止DMN刺激后投予CME治疗，用药2周时门静脉压力与门静脉管径显著低于6周模型对照大鼠，用药4周时门静脉压与门静脉管径已回复至同期正常大鼠的水平。显示出CME具有良好的降低DMN大鼠门静脉压增高的效应。

    结合肝组织学及血清HA含量的变化结果可以看出，CME干预用药3 d时可以显著抑制肝窦壁Ⅳ型胶原的降解，2周时肝窦壁CD44阳性染色显著增加，vWF和α?SMA阳性染色显著减少，LM和Col Ⅰ沉积减少；4周时包括血清HA含量在内的所有观测指标与同期模型对照组相比，均显著改善；对于已造模成型的DMN大鼠肝硬化，治疗用药2周后，上述各指标除Col Ⅳ外，较同期模型对照组均有显著改善，治疗用药4周时，肝窦壁CD44染色显著增加，α?SMA阳性染色及LM和Col Ⅰ沉积均显著减少。此动态观察结果充分显示出CME保护肝窦壁、抗肝窦壁损伤以及促进损伤肝窦壁修复的综合作用，可以认为这是CME干预治疗二甲基亚硝胺大鼠肝硬化门静脉高压效应的组织学基础。

【】
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