血府逐瘀口服液对冠心病血瘀证患者血液流变学的影响及其与人类血小板抗原3基因多态性的相关性

             作者：薛梅, 陈可冀, 马晓娟, 刘剑刚, 蒋跃绒, 缪宇, 殷惠军

【摘要】  目的：观察血府逐瘀口服液对冠心病血瘀证患者血液流变学的影响，分析其与血小板膜糖蛋白Ⅱb（glycoprotein Ⅱb, GPⅡb）人类血小板抗原3(human platelet antigen?3, HPA?3)基因多态性的相关性。方法：筛选符合入选标准的32例冠心病血瘀证患者，进行血瘀证计分并检测血液流变学，采用TaqMan探针技术检测GPⅡb HPA?3基因多态性，血府逐瘀口服液4周后复查血液流变学并进行血瘀证计分。 结果：血府逐瘀口服液治疗后冠心病血瘀证患者血液流变学得到改善，含有至少一个突变型基因C的患者治疗前后血液黏度、红细胞变形指数及血瘀证计分与AA型患者比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：血府逐瘀口服液能减轻冠心病血瘀证患者的血瘀症状，改善冠心病血瘀证患者的血液流变性，这种改善作用与GPⅡb HPA?3基因多态表型有相关性。

【关键词】  血府逐瘀口服液; 冠心病; 血瘀; 血液流变学; 血小板膜糖蛋白Ⅱb; 基因

    Objective: To investigate the effects of Xuefu Zhuyu Oral Liquid, a compound traditional Chinese herbal medicine for resolving stagnation, on hemorheology in the patients with blood?stasis syndrome due to coronary disease and their relationship with human platelet antigen?3 (HPA?3) polymorphism of membrane glycoprotein Ⅱb (GPⅡb).

    Methods: Thirty?two patients with blood?stasis syndrome due to coronary disease were selected in this study. Blood?stasis syndrome scoring was performed and hemorheological parameters were measured in all subjects before and after Xuefu Zhuyu Qral Liquid treatment. The genotypes of GPⅡb HPA?3 were determined by TaqMan probe technology.

    Results: The hemorheology was improved in the patients with blood?stasis syndrome due to coronary heart disease after the treatment. There were significant differences in the whole blood viscosity, deformation index of red blood cells and scores of blood?stasis syndrome between the patients carrying AC plus CC and the patients carrying AA after the treatment (P＜0.05).

    Conclusion: Xuefu Zhuyu Oral Liquid can improve clinical symptoms and hemorheology in the patients with blood?stasis syndrome due to coronary heart disease, which is related to GPⅡb HPA?3 polymorphism.

    Keywords: Xuefu Zhuyu Oral Liquid; coronary heart disease; blood stasis; hemorheology; platelet membrane glycoprotein Ⅱb; genes

    冠心病是多基因疾病，随着人类基因组计划的迅速，冠心病相关基因的定位与识别已成为研究的热点。基因多态性是近年来遗传性危险因素的一个热点研究领域，有证据表明血小板糖蛋白Ⅰb（glycoprotein Ⅰb, GPⅠb）、GPⅡb?Ⅲa和GPⅠa?Ⅱa的基因多态性增加了冠状动脉血栓形成和冠状动脉事件发生的危险性［1?4］。近来有研究进一步证实，某些基因多态位点与不同个体对阿司匹林的反应性不同有关［5］。血瘀证是冠心病最常见的证型之一。中医“证”既与致病因素的性质和强弱有关，更与患者个体的体质因素有关，而正是基因的差异表达决定了个体的差异。为明确冠心病血瘀证患者对活血化瘀疗法的不同反应是否与相关基因多态性有关，我们选择冠心病形成过程中在血小板聚集和血栓增长中起关键作用的GPⅡb?Ⅲa［6］为研究切入点，观察血府逐瘀口服液对冠心病血瘀证患者血液流变学的影响，分析其与人类血小板抗原3膜糖蛋白Ⅱb（human platelet antigen?3 polymorphism of membrane glycoprotein Ⅱb, GPⅡb HPA?3）基因多态性的相关性。

    1  资料与方法

    1.1  研究对象的选择  所收集病例为北京、河北地区无血缘关系汉族人，全部来源于2005年3月至2007年1月就诊于中医院西苑者，所有入选病例皆签署知情同意书。冠心病的诊断均符合世界卫生组织临床命名标准化联合专题组报告《缺血性心脏病的命名及诊断》［7］标准，选择有心绞痛症状和（或）心肌缺血的客观证据，且冠状动脉造影证实冠状动脉有显著狭窄（＞50%）者。中医辨证标准参照中国中西医结合学会《冠心病中医辨证标准》［8］。血瘀证计分标准中国中西医结合学会活血化瘀专业委员会制定的《血瘀证诊断标准》［9］，并结合冠心病患者的发病特点，按［10］方法进行评分。纳入病例标准：（1）缺血性心脏病，中医辨证分型为血瘀证者；（2）患者有心绞痛症状和（或）心肌缺血的客观证据；（3）近期冠状动脉造影证实冠状动脉有显著狭窄（＞50%）；（4）年龄在35～75岁。凡同时具备以上4条者，均纳入试验范围。排除标准：近2周内服用活血化瘀中药、抗血小板药物或抗凝药物者；严重感染；严重心功能不全（射血分数＜35%）；未控制的Ⅲ级高血压患者；严重瓣膜性心脏病；1型糖尿病；合并严重肝、肾、造血系统、神经系统等原发性疾病及精神病、恶性肿瘤患者；患者拒绝签署知情同意书，或估计依从性较差；参加其他临床试验的患者；妊娠期或哺乳期妇女。

    1.2  治疗方法  血府逐瘀口服液，由桃仁、红花、当归、川芎、赤芍、柴胡等组成，吉林敖东延边药业股份有限公司生产，生产批号为050801，每次10 ml，3次/d，饭后30 min服用，临床观察4周。入选病例提取基因组DNA，检测基因多态性，治疗前后分别进行血瘀证计分，检测血液流变学。

    1.3  观察指标及方法

    1.3.1  血液流变学  血液黏度采用锥?板法测量，仪器为LBY?N6型血液黏度计，北京普利生公司生产；血小板黏附性采用旋转玻球法，血小板黏附率，仪器为XSY?RⅡ型血小板黏附测定仪，江苏省无锡仪器二厂生产；血小板聚集性采用比浊法，仪器为LBY?NJ2型血小板聚集仪，北京普利生公司生产；诱导剂为二磷酸腺苷，浓度0.2 mmol/L，生产批号为704P01，美国Biopool International公司生产；红细胞变形性采用激光衍射法，红细胞聚集指数采用光密度法测量，仪器为LBY?BX2型红细胞功能激光测定仪，北京普利生公司生产。

    1.3.2  基因多态性

    1.3.2.1  基因多态性主要检测仪器及试剂  高速冷冻离心机（Sigma 3k?30、SORVALL RT 7)；ABI 9700型聚合酶链反应（polymerase chain reaction, PCR）仪；ABI 7700 HT型荧光定量PCR仪；DNA 提取试剂盒Wizard Genomic DNA Purification Kit (Promega)；普通PCR试剂Ex Taq DNA聚合酶，P/N：DRR100B，Lot：CKA1801A（大连宝生物工程有限公司）；荧光定量试剂ABI TaqMan 2×PCR Master mix，P/N：4326614，Lot：G15502。

    1.3.2.2  基因组DNA提取  入选病例皆清晨空腹抽取静脉血2 ml，乙二胺四乙酸抗凝。将300 μl血样加入含900 μl Cell Lysis Solution的离心管中，室温放置10 min，13 000～16 000×g离心20 s，移弃大部分上清液，剩余约10～20 μl。震荡离心管10～15 s后，加入Nuclei Lysis Solution 300 μl，并吹吸5～6次后，加入RNase Solution 1.5 μl，37 ℃水浴15 min，冰上冷却5 min。加入Protein Precipitation Solution 100 μl震荡10～20 s，13 000～16 000×g离心3 min。取上清液加入含300 μl异丙醇的离心管中，摇动直至出现大量白色DNA沉淀，离心1 min，弃上清液，加入75%乙醇翻转冲刷管壁，离心1 min，吸去上清液，室温干燥10～15 min，加入DNA Rehydration Solution 100 μl 4 ℃过夜，－20 ℃存放。

    1.3.2.3  基因多态性检测位点确认  GPⅡb存在多个基因位点的变异，HPA?3 (Baka/Bakb)基因多态位点描述见表1。表1  GPⅡb HPA?3 (Baka/Bakb)多态位点

    1.3.2.4  基因多态性检测方法和步骤  GPⅡb的多态性检测采用TaqMan探针技术。TaqMan探针技术包括普通TaqMan、TaqMan MGB、TaqMan LNA，虽然后两者灵敏度和特异性较前者要高，但由于我们所检测的序列GC含量较高，所以采用更为适合的普通TaqMan探针。

    GPⅡb HPA?3 (Baka/Bakb)多态位点探针和引物采用ABI Primer Express 2.0软件设计：XM?rs5911?FAM(t), FAM?TGCCCATCCCCAGCCC C?TAMRA，Tm=66，GC%=76.5，length=17；XM?rs5911?VIC(g), VIC?CTGCCCAGCCCCAGC CC?TAMRA，Tm=65.9，GC%=82.9，length=17；XM?rs5911?FP, GGCCTGACCACTCCTTTG C，Tm=59.2，GC%=63.2，length=19；XM?rs5911?RP，TCACTACGAGAACTGGATCCTGA?A， Tm=58.9，GC%=45.8，length=24。Ampli?con：Tm=87，GC%=66，length=157。

    将所有样本DNA浓度（5～15 μg/100 μl）调整到20～50 ng/μl。引物检测见表2。表2  GPⅡb引物检测PCR反应体系GPⅡb引物检测PCR循环条件：预变性94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。探针检测见表3。表3  GPⅡb探针检测PCR反应体系

    GPⅡb探针检测PCR循环条件：预变性95 ℃ 10 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，40个循环。

    引物和探针检测通过后，按照上述探针检测反应条件进行正式实验，检测PCR产物荧光强度变化，用ABI 7700 HT型荧光定量PCR仪，按7700用户手册操作。

    1.4  统计学方法  统计分析采用SPSS 11.5统计分析软件，α=0.05为判别有统计学意义的检验水准。计数资料用卡方检验，两组计量资料采用t检验，多组均数间的显著性检验采用方差分析。

    2  结  果

    2.1  一般资料  共入选冠心病血瘀证患者36例，因个人原因脱落4例，32例患者中男性20例，女性12例，平均年龄（59.6±8.7）岁，体质量指数（26.2±3.0）kg/m2，有心肌梗死病史者6例，有高血压病史者22例，有血脂紊乱病史者9例，有糖尿病病史者9例，有吸烟史者16例。治疗过程中有2例病人大便稀，减少药量后好转，经检查发现血、尿常规和肝肾功能等治疗前后无药物性异常变化，未见其他不良反应。

    2.2  HPA?3 (Rs5911)多态位点表达情况  32例患者中表达AA基因型者8例，AC基因型18例，CC基因型6例。见图1。

    2.3  血府逐瘀口服液对病人血液流变学的影响  服用血府逐瘀口服液后，含有至少一个突变型基因C的患者与AA型患者血液黏度（剪切率1.0 s?1、5.0 s?1、10.0 s?1）比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表4。

    服用血府逐瘀口服液后，含有至少一个突变型基因C的患者红细胞变形指数与AA型患者比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；而红细胞聚集率、红细胞压积和血浆黏度等的差异则无统计学意义（P＞0.05)。见表5。

    服用血府逐瘀口服液后，含有至少一个突变型基因C的患者血小板最大聚集率、血小板黏附率和纤维蛋白原含量与AA型患者比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表5。

    2.4  血府逐瘀口服液对不同基因型血瘀证证候计分的影响  服用血府逐瘀口服液后，含有至少一个突变型基因C的患者治疗前后血瘀证计分比较，差异有统计学意义（P＜0.01），AA型患者血瘀证计分治疗前后比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表6。表4  不同基因型治疗前后的血液黏度表5  不同基因型治疗前后血液流变学表6  不同基因型治疗前后血瘀证证候计分

    3  讨  论

    冠心病形成过程中，GPⅡb?Ⅲa在血小板聚集和血栓增长中起关键作用，有多个多态位点，其中发现最早的血小板?白细胞聚集体（platelet?leukocyte aggregate, PLA）（HPA?1）基因多态位点为近年来研究热点内容之一。国外有研究报道PLA2多态性可能与心肌梗死病人的抗血小板疗效有关［11］；阿司匹林抵抗患者的PLA2基因型表达明显高于有效者，所有表达PLA2基因型的患者阿司匹林治疗效果欠佳［5］。但亦有报道，PLA2基因携带者和PLA1/A1纯合基因型急性心肌梗死患者心肌再灌注指数、最终梗死面积及18个月内死亡率的差异均无统计学意义，PLA多态性与急性心肌梗死患者的心肌再灌注疗效无关［12］。而我们前期研究证实PLA2基因型在我国人群中表达率极低，冠心病发病与该多态位点无相关性(待发表)。GPⅡb?Ⅲa另一发现较早的HPA?3基因多态位点在汉族人中突变型表达率较高，国际人类基因组单体型图计划检测结果显示，45位无血缘关系的北京汉族人3种表型HPA?3a/3a、HPA?3a/3b、HPA?3b/3b分别占33.1%、40%、26.7%。因此我们选择HPA?3基因多态位点作为研究的切入点。

    证候研究一直是中医领域的研究热点。证作为机体对致病因素做出反应后所处的一种功能状态，既与致病因素的性质、强弱有关，更与患者个体的体质因素有关，即中医所谓同病异证、异病同证。基因组学认为基因表达差异及基因序列的多态性（群体中正常个体的基因在相同位置上存在差别）决定了个体的差异，可见证候与基因表达差异及基因多态性之间可能存在密切的内在联系。目前已有不少学者从基因水平上对证的实质研究作了有益探索［13?18］，而关于基因多态性与中医疗效的相关性研究尚未见报道。

    中医学认为“血和则经脉流行”，“血凝而不流”，“血瘀滞而不行”。血瘀证与“血行”有关。《金匮要略》中有“内结为血瘀”之说，《证治准绳·蓄血篇》中亦有“百病由污血者多”的论述。“内结为血瘀”作为引起“血脉不通”的一种因素，往往有血液本身组成成分的改变，而所谓“污血”则为血瘀产生的前提或结果。血瘀证还与血液成分的改变有关。既往大量研究证实［19］血瘀证患者多有血液流变性和血液黏度的异常，血液流变学是反映血瘀证的重要指标之一。

    本研究显示服用血府逐瘀口服液后，含有至少一个突变型基因C的患者血液黏度、红细胞变形指数及血瘀证计分与AA型患者比较，差异有统计学意义（P＜0.05），说明含有至少一个突变型基因C的患者AA型对血府逐瘀口服液的治疗反应性更好，症状改善更明显。因而HPA?3基因多态位点可能是患者对活血化瘀治疗是否敏感的一个基因标志物。由于样本量比较少，尚需进一步扩大样本研究以证实，这对从基因水平阐释活血化瘀疗效个体化差异具有十分重要的意义，也为实现冠心病血瘀证患者个体化治疗提供了新的研究思路。

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