补益气血方剂对大鼠慢性难愈性创面血管内皮生长因子及血管生成的影响

【摘要】  探讨补益气血方剂四君子汤、四物汤和八珍汤对慢性难愈性创面大鼠创面血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及微血管数（microvessel count，MVC）的影响。方法：在90只雄性SD大鼠背部制造全层皮肤缺损开放性创面。除正常对照组外，大鼠肌肉注射醋酸氢化可的松建立难愈性创面模型，随机分为模型组、四君子汤组、四物汤组和八珍汤组。观察创面愈合时间；通过免疫组化结合图像分析等技术，观察各组大鼠创面肉芽组织中VEGF表达情况和MVC。 结果：模型组创面愈合时间较正常组明显延长（P<0.01），各组创面愈合时间比模型组缩短（P<0.01，P<0.05），四物汤组和八珍汤组创面愈合时间较四君子汤组延长（P<0.05）。模型组VEGF表达和MVC明显低于正常对照组（P<0.01），各治疗组VEGF表达和MVC高于模型对照组（P<0.01，P<0.05），低于正常对照组（P<0.01）。四物汤组和八珍汤组VEGF表达和MVC低于四君子汤组（P<0.05，P<0.01），四物汤组和八珍汤组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。结论：补益气血方剂能明显促进慢性难愈性创面大鼠的创面愈合，其机制可能与上调VEGF表达水平，诱导血管新生有关。

【关键词】  慢性难愈性创面 创面修复 补益气血 血管内皮生长因子 大鼠

    Objective: To explore the effects of reinforcing qi and nourishing blood recipes on vascular endothelial growth factor (VEGF) and the microvessel count (MVC)in granulation tissue in rats with chronic skin ulcers.

    Methods: A total of 90 male SD rats with back full?thickness skin lesion were used in this study. Except for the normal control group, the rats were injected with hydrocortisone for inducing chronic skin ulcers, and were randomly divided into untreated group, Sijunzi Decoction group, Siwu Decoction group and Bazhen Decoction group. The time of wound healing was observed; immunohistochemical method and image analytical method were used to test the expressions of VEGF and MVC in granulation tissue of dermal chronic ulcers in the rats.

    Results: In the untreated group, the time of wound healing was significantly longer than that in the normal group (P<0.01). The time of wound healing was obviously shortened in the three treated groups as compared with the untreated group (P<0.01, P<0.05). In the Sijunzi Decoction group, the time of wound healing was obviously shorter than those in Siwu Decoction group and Bazhen Decoction group (P<0.05, P<0.01). In the untreated group, the expression of VEGF and MVC were significantly lower than those in the normal control group (P<0.01). The expression of VEGF and MVC were obviously increased in the three treated groups as compared with those in the untreated group (P<0.01, P<0.05). In the Sijunzi Decoction group, the expression of VEGF and MVC were obviously lower than those in Siwu Decoction group and Bazhen Decoction group (P<0.05, P<0.01).

    Conclusion: Reinforcing qi and nourishing blood recipes can promote wound healing in rats through up?regulating the expression of VEGF in granulation tissue of dermal chronic ulcers, and inducing angiogenesis.

    Keywords: dermal chronic ulcer; wound healing; qi?blood reinforcing; vascular endothelial growth factor; rats

    慢性难愈性创面是因各种原因导致的局部组织缺损，创面难以愈合且愈合后创面每因损伤而复溃，是外科常见病，多发病。我们在长期的临床实践中发现，补益气血方剂治疗慢性难愈性创面有较好的疗效。为进一步探讨补益气血方剂促进创面愈合的作用机制，开展了以下研究。

    1  材料与方法

    1.1  实验材料

    1.1.1  实验动物  90只雄性SD大鼠，清洁级，2月龄，体质量200～250 g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，动物合格证号为医动字第02?22?2号。

    1.1.2  实验药物  四君子汤（《太平惠民和剂局方》）由党参9 g、白术9 g、茯苓9 g、甘草6 g组成，减压浓缩至浓度为0.36 g/ml，大鼠用药剂量为生药2.90 g/(kg·d)。四物汤（《太平惠民和剂局方》）由熟地黄12 g、当归9 g、白芍药9 g、川芎6 g组成，减压浓缩至浓度为0.40 g/ml，大鼠用药剂量为生药3.17 g/(kg·d)。八珍汤（《正体类要》）由党参9 g、白术9 g、茯苓9 g、甘草6 g、熟地黄12 g、当归9 g、白芍药9 g、川芎6 g组成，减压浓缩至浓度为0.76 g/ml，大鼠用药剂量为生药6.07 g/(kg·d)。以上中药均由上海中医药大学龙华制剂室按水煎醇沉工艺制备，4 ℃冰箱保存备用。

    1.1.3  主要实验试剂  免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白?过氧化物酶连接法（streptavidin?biotin peroxidase method, SP）试剂盒，购自美国Zymed公司；即用型EnVision试剂，购自丹麦Dako公司；血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）一抗（兔抗鼠，分别1∶100、1∶50稀释），购自美国Santa Cruz公司；生物素标记的羊抗兔免疫球蛋白G（immunoglobulin G, IgG），购自德国Vector公司；辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase, HRP）标记山羊抗小鼠抗体，购自北京中山公司；注射用氢化可的松琥珀酸钠（50 mg/支），购自天津市生物化学制药厂。

    1.1.4  主要实验仪器  IMS细胞图像分析系统和医学图像分析软件，购自上海申藤信息技术有限公司；摄像机（型号：MV?CP410），购自Panasonic公司；光学显微镜，购自Olympus公司；BH2数码相机，购自Nikon公司。

    1.2  实验方法

    1.2.1  慢性难愈性创面大鼠模型的建立  大鼠常规饲养1周后，盐酸氯胺酮（100 mg/kg）腹腔注射麻醉，造模区（腰椎正中偏上）剪毛，用直径20 mm的塑料瓶盖在造模区标记造模面积，在无菌条件下，沿脊椎方向用外科方法作两条深达筋膜的创面，建立全层皮肤缺损开放性创面模型［1］。除正常对照组外，大鼠造模后即刻肌注醋酸氢化可的松（80 mg/kg体质量），制成难愈性创面模型。创面加盖两层消毒干纱布，用胶布“丰”字形固定。造模后每只大鼠连续4 d后肢肌肉注射青霉素40万U，以预防感染。

    1.2.2  实验动物分组与给药方法  90只大鼠分2批进行实验。第1批40只大鼠主要用于观察药物对创面愈合时间的影响。40只大鼠先抽取8只为正常对照组，创面制作方法同前，其余32只大鼠建立慢性难愈性创面模型。成模后再随机分为模型组（8只）、四君子汤组（8只）、四物汤组（8只）、八珍汤组（8只）。第2批50只大鼠主要用于探讨药物促创面愈合的机制。50只大鼠先抽取10只为正常对照组，创面制作方法同前，其余40只大鼠建立慢性难愈性创面模型。成模后再随机分为模型组（10只）、四君子汤组（10只）、四物汤组（10只）、八珍汤组（10只）。各组于造模后第2天开始给药，换药前均以1/5 000呋喃西林溶液清洁创面。正常对照组及模型组外敷单层生理盐水纱布，生理盐水灌胃，1次/d；四君子汤组、四物汤组和八珍汤组外敷单层生理盐水纱布，予相应的中药灌胃，1次/d，连续用药7 d。停药后第2天，分别将动物氯胺酮麻醉处死，取局部创面新生肉芽组织进行检测。

    1.2.3  创面愈合时间的观察  观察40只大鼠从创面用药起到创面完全上皮化所需时间。

    1.2.4  VEGF及微血管数的检测

    1.2.4.1  免疫组化SP法检测VEGF表达  取各组大鼠创面新生肉芽组织，生理盐水清洗后，10%甲醛溶液固定。每组随机选取8个样本，将已固定的各肉芽组织标本分别常规脱水、浸蜡、包埋，连续切片。取4 μm石蜡切片，二甲苯常规脱蜡，梯度酒精脱水，PBS洗涤，3 min×3次；3％H2O2室温20 min，PBS洗涤，3 min×3次；将切片浸入0.01 mol/L pH 6.0柠檬酸盐缓冲液中，微波炉Ⅲ档（98 ℃）10 min×2次进行抗原修复，取出后在室温下冷却；滴加10%正常血清封闭内源性非特异性抗原，室温30 min；滴加VEGF一抗（分别为上述抗体及相应抗体稀释度），4 ℃冰箱过夜；PBS洗涤，3 min×3次，滴加生物素化羊抗兔IgG 1︰200，37 ℃ 30 min，PBS洗涤，3 min×3次；Streptavidin?HRP 1︰200 37 ℃ 30 min，PBS洗涤，3 min×3次，0.05％ DAB＋0.03％ H2O2显色8～12 min，流水洗；苏木素衬染，流水洗；吹干，常规树脂封片。检测以胞浆出现棕黄色或棕褐色颗粒者判定为阳性细胞，以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。

    1.2.4.2  图像分析法分析VEGF表达量及微血管数  采用MV?CP410摄像机、IMS细胞图像分析系统，通过显微镜、图像采集卡、数码相机或CCD摄像机采集数字图像，数字图像为标准的BMP（位图）文件格式；在100倍光学显微镜下，先点击图像微尺上的两个点，再将其实际微米数输入机，计算机自动计算得到比例因子后存储备用；消除免疫组化图像中的紫蓝色背景，选择阴性区域，处理后用蓝色表示；选择棕黄色或棕褐色阳性区域，处理后用红色表示；测定图像中阳性区域面积和阳性比率以及光密度值，每张切片随机选取3个视野，求出3个视野的平均值，计算VEGF表达水平。每张石蜡切片，随机选取肉芽组织区域的3个视野，求出3个视野的平均值，计数微血管的数目（microvessel count，MVC）。

    1.3  统计学方法  采用SPSS 11.5软件进行数据分析，计量数据用x±s表示，进行t检验或多个样本单因素方差分析(q检验)比较组间差异是否有统计学意义。

    2  结  果

    2.1  补益气血方剂对慢性难愈性创面愈合时间的影响  模型组创面愈合时间较正常对照组明显延长（P<0.01）；与模型组比较，四君子汤组、八珍汤组和四物汤组创面愈合时间明显缩短（P<0.01，P<0.05）；四君子汤组创面愈合时间与正常对照组比较差异无统计学意义（P>0.05），四物汤组和八珍汤组创面愈合时间明显长于正常对照组（P<0.05）；与四君子汤组比较，四物汤组和八珍汤组创面愈合时间延长（P<0.05）；四物汤组与八珍汤组创面愈合时间比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。表1  各组创面愈合时间

    2.2  补益气血方剂对慢性难愈性创面肉芽组织VEGF表达的影响  模型组VEGF的表达水平明显低于正常对照组（P<0.01）；四君子汤组、四物汤组和八珍汤组VEGF表达明显高于模型组（P<0.01，P<0.05），但均低于正常对照组（P<0.01）。四物汤组和八珍汤组VEGF表达低于四君子汤组（P<0.05）。四物汤组与八珍汤组比较，VEGF表达差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

    2.3  补益气血方剂对慢性难愈性创面肉芽组织MVC的影响  模型组MVC明显低于正常对照组（P<0.01）；各组MVC明显高于模型对照组（P<0.01），但均低于正常对照组（P<0.01）。四物汤组和八珍汤组MVC均明显低于四君子汤组（P<0.01）。四物汤组MVC与八珍汤组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。 表2  各组创面肉芽组织VEGF表达和MVC

    3  讨  论

    慢性难愈性创面的发生、和变化是因虚感邪，邪气致瘀，瘀阻伤正，化腐致损的过程，“虚”、“瘀”为其基本病机及难愈合的关键［2］，而正气虚损、肤失荣养是创面难以愈合的根本及始动环节。我们依据《素问》“治病必求其本”、“虚者补之，损者益之”的原则，确立了补益虚损，促进机体正气恢复，修复组织缺损为治病求本之大法。补益虚损中，尤注重益气健脾、调补气血。脾胃为后天之本，气血生化之源；脾主肌肉，脾胃旺则元气足，气血生化充盛，肌肉得其濡养而发达、丰满、健壮，创面易于修复。结合《外科精要》“不生肌，不收敛，脾气虚也”和《外科理例》“生肌之法，当先理脾胃，助气血为主，则肌肉自生”等理论，临证运用四君子汤、四物汤和八珍汤等经典方剂益气健脾、调补气血，补益虚损，治疗慢性难愈性创面，取得了显著效果，能明显促进与加速疮面愈合、提高愈合质量。

    《医林改错》曰：“元气既虚，必不能达于血管，血管无气，必停留而瘀。”《医学衷中参西录》：“因气血虚者，其经络多瘀滞”。气为血帅，正气虚损则无力推动血行，使气血运行稽迟，瘀血内生，停留于局部；瘀血不去，新血不生，正气无由恢复，则正气耗损益剧。两者互为因果，形成恶性循环，而致肌肤失养，创面难愈。本实验研究结果表明，模型组创面较正常对照组难于愈合，愈合时间较正常对照组明显延长（P<0.01），各治疗组创面愈合时间低于模型组（P<0.01，P<0.05），提示四君子汤、四物汤和八珍汤补益正气，均能促进正气来复，从而推动局部气血运行，恢复气血正常运行的整体环境而促进创面愈合。四君子汤作用优于四物汤和八珍汤，这可能与气血的功能与十二经络气血多少密切有关。气有推动、温煦的作用，而血具有滋润、濡养的功能。四君子汤益气健脾，促进气血化生，荣养创面，同时气旺推动血行，在补气的同时兼顾了祛瘀，在一定程度上改善血液循环，达到流畅气血，消除瘀浊的作用，从而促使创面早日生肌敛疮收口；而四物汤养血补血，八珍汤益气生血，可能主要起濡养作用，而行血的作用相对较少。同时，慢性难愈性创面模型创面建立在大鼠背部，其为足太阳膀胱经部位，足太阳膀胱经为多血少气之经，四物汤、八珍汤养血为主，促使局部阴血旺盛，“血多则凝滞必甚”，从而不利于局部气血的流畅和瘀浊的消除。故四君子汤促进创面愈合的效果优于四物汤组和八珍汤组，实验结果印证了中医学“脾主肌肉”、“血主濡之”以及“气能行血”等理论，同时也提示在运用补益气血方剂治疗慢性难愈性创面时，如增强活血化瘀药物的作用，有可能进一步提高临床疗效。

    研究表明，创面修复是一个连续的复杂过程，肉芽组织形成是创面修复愈合的关键步骤之一，而肉芽组织的本质是大量的毛细血管和丰富的成纤维细胞。肉芽组织是否形成及质量的好坏，可直接影响创伤愈合的程度及其预后，其中毛细血管再生及血管网的形成在其中亦起着极其重要的作用。丰富的新生毛细血管数量和形态，能充实肉芽组织且改善创面微循环，为组织修复提供所必须的氧及丰富的营养物质，从而有利于创面愈合［1, 3］。创面新生血管的生长对于创面肉芽组织的形成，创伤的愈合，以及减少瘢痕组织的产生和减少感染的发生尤为重要［4］。血管新生是创面修复愈合过程中的重要机制，是创面修复愈合的关键环节。VEGF是影响血管新生的关键生长因子之一［5］，是一种作用最强，且唯一特异性作用于血管内皮细胞的促血管生成因子。它既可提高血管通透性，又可直接作用于血管内皮细胞，刺激其分裂增殖，诱导新生血管生成并影响微血管的量，从而促进创面的生长愈合［6］。有学者认为，创伤表面VEGF的持续分泌对于加速创伤愈合具有非常重要的意义［7］。本实验研究结果发现，模型组VEGF表达水平和MVC均明显低于正常对照组（P<0.01），提示局部组织呈缺血状态，从而导致溃疡创面难以愈合。各治疗组VEGF表达水平和MVC明显高于模型组（P<0.01, P<0.05），提示补益气血方剂均能上调VEGF的表达水平，诱导血管新生，在一定程度上改善局部组织的缺血状态，促进创面修复愈合。

【】
  1 Fu XB, Wang DW. Contemporary wound repair. Beijing: People's Military Medical Press. 1999: 229?230. Chinese.

付小兵, 王德文. 创伤修复学. 北京: 人民军医出版社. 1999: 229?230.

2 Que HF, Tang HJ, Wang LY, et al. Study on wound healing mechanism of replenishing qi and dissipating stagnation therapy for chronic skin ulcers. Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao. 2005; 3(3): 243?246. Chinese.

阙华发, 唐汉钧, 王林扬, 等. 益气化瘀法促进慢性难愈性创面修复愈合的机制研究. 中西医结合学报. 2005; 3(3): 243?246.

3 Galeano M, Deodato B, Altavilla D, et al. Effect of recombinant adeno?associated virus vector?mediated vascu1ar endothelial growth factor gene transfer on wound healing after burn injury. Crit Care Med. 2003; 31(4): 1017?1025.

4 Pierce GF, Tarpley JE, Allman RM. Tissue repair processes in healing chronic pressure ulcers treated with recombinant platelet?derived growth factor BB. Am J Pathol. 1994; 145(6): 1399?1410.

5 Tuan TL, Nichter LS. The molecular basis of keloid and hypertrophic scar formation. Mol Med Today. 1998; 4(1): 19?24.

6 Dvorak HK. Angiogenesis: update 2005. J Thromb Haemost. 2005; 3(8): 1835?1842.

7 Xu WR, Wang L, Zhao HF, et al. Application of human vascular endothelial growth factor gene?modified engineering membrane in promoting rat wound healing. Wai Ke Li Lun Yu Shi Jian. 2006; 11(3): 244?247. Chinese with abstract in English.