柴芩承气汤减轻急性胰腺炎大鼠胰腺钙超载的机制研究

【摘要】  观察柴芩承气汤（Chaiqinchengqi decoction, CQCQD）对急性胰腺炎大鼠胰腺组织肌浆网钙ATP酶（sarcoendoplasmic reticulum Ca2+?ATPase, SERCA）mRNA表达的影响。方法：30只SD大鼠随机分成正常对照组、模型组及CQCQD组。采用蛙皮素腹腔注射法建立急性胰腺炎大鼠模型。逆转录聚合酶链式反应检测胰腺组织SERCA1和SERCA2 mRNA表达的变化；激光共聚焦显微镜检测腺泡细胞内钙离子浓度，并比较各组大鼠胰腺组织病理变化。结果： SERCA1 mRNA在正常胰腺和急性胰腺炎胰腺腺泡细胞均不表达。模型组与正常对照组比较，腺泡细胞SERCA2 mRNA表达下调，表达率为0.536（P=0.001）；CQCQD组与模型组比较，腺泡细胞SERCA2 mRNA的表达上调，表达率为1.803（P=0.035）。模型组大鼠细胞内钙离子的荧光强度高于正常对照组及CQCQD组（P＜0.05）；CQCQD组大鼠胰腺组织的病理评分低于模型组（P＜0.05）。结论：CQCQD可以通过上调SERCA2 mRNA表达，减缓胰腺细胞内钙超载，减轻胰腺组织的病理改变。

【关键词】  柴芩承气汤 急性胰腺炎 钙超载 肌浆网钙ATP酶

    Objective: To investigate the mechanism of Chaiqin Chengqi Decoction (CQCQD), a compound of traditional Chinese herbal medicine, acting on the pancreatic acinar cell calcium overload in rats with acute pancreatitis (AP).

    Methods: A total of 30 SD rats were randomly divided into normal control group, untreated group and CQCQD group (n=10, respectively). AP was induced in rats by caerulein (5×50 μg/kg) intraperitoneal injection within 4 h. The pancreatic tissue SERCA1 and SERCA2 mRNA expressions were detected by fluorescent quantization polymerase chain reaction method; intracellular calcium fluorescence intensity (FI) of pancreatic acinar cells and the pancreatic pathological score were measured by laser scanning confocal microscopy and light microscopy respectively.

    Results: There were no SERCA1 mRNA expressions in pancreatic acinar cells of rats in the normal control group and the untreated group. The expression of pancreatic SERCA2 mRNA in the untreated group was down?regulated compared with that in the normal control group (expression ratio=0.536; P=0.001); the expression of pancreatic SERCA2 mRNA in the CQCQD group was up?regulated compared with that in the untreated group (expression ratio=2.00; P=0.012). The pancreatic pathological score in the CQCQD group was lower than that in the untreated group and the FI of Ca2+ was also lower.

    Conclusion: CQCQD can up?regulate the expression of pancreatic SERCA2 mRNA, release the calcium overload, and hence reduce the pathological changes in pancreatic tissue.

    Keywords: Chaiqin Chengqi Decoction; acute pancreatitis; calcium overload; sarcoendoplasmic reticulum Ca2+?ATPase

    急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）发病机制有各种学说，其中胰腺腺泡细胞钙超载学说得到了广大学者的认可。该学说认为，急性胰腺炎腺泡细胞肌浆网钙ATP酶（sarcoendoplasmic reticulum Ca2+?ATPase，SERCA）活性降低，不能及时将钙离子从胞浆中转运回肌浆网，导致胞浆内钙水平升高，作用于钙离子依赖性钙通道，从而导致细胞外钙内流及细胞内钙释放，进一步加重其钙超载。SERCA包括SERCA1、SERCA2和SERCA3 3个亚型，其中SERCA3在胰腺组织不表达。

    我们的先期实验发现，柴芩承气汤（Chaiqin Chengqi Decoction，CQCQD）含药血清能减轻AP大鼠胰腺腺泡细胞钙超载，并对AP时的胰腺细胞有保护作用［1］，但是其机制尚不清楚。本研究通过动物实验，研究与急性胰腺炎腺泡细胞钙超载相关的SERCA1和SERCA2 mRNA表达的变化，以及柴芩承气汤对上述变化的影响。

    1  材料与方法

    1.1  实验材料

    1.1.1  主要试剂和仪器  蛙皮素、大豆酶抑制剂、牛血清白蛋白及Fluo?3?AM购于美国Sigma公司；胶原酶P及焦碳酸二乙酯购于美国Roche公司；高糖达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM）（粉状）购于美国Sigma公司；TRIzol试剂为美国MRC公司产品；Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液、MgCl2溶液购于北京BioDev生物基因技术有限公司；dTNP购于美国Promega公司；DNA marker购于北京Tiangen公司；琼脂糖（电泳级）购于法国Biowest公司。激光共聚焦显微镜（laser scanning confocal microscope, LSCM）及其荧光定量分析软件（Leica TCS?sp2）为德国Zeiss公司产品，普通光学显微镜（Leica 020?518.5）为日本Olympus公司产品。FTC2000实时荧光定量基因扩增仪为加拿大Funglyn公司产品。

    1.1.2  柴芩承气汤的制作  柴芩承气汤组成：柴胡、黄芩、厚朴、枳实、栀子及茵陈各15 g免煎中药（相当于饮片各15 g），大黄和芒硝各30 g，从四川大学华西药房购得。每剂中药由四川大学华西医院煎药室水煎成200 ml汤剂，再用冻干机制成冻干粉，封存于－40 ℃的冰箱中备用。实验前，用双蒸水配制成2 g生药/ml制剂。

    1.1.3  实验动物  30只健康SD大鼠，雌雄不限，3月龄，体质量250～300 g，四川大学华西医学中心实验动物中心提供，合格证号为川实动管字第11号。

    1.2  实验方法

    1.2.1  动物模型制作  30只健康SD大鼠随机分成正常对照组、AP组和CQCQD组，每组10只。除正常对照组大鼠外，20只大鼠采用蛙皮素腹腔注射制作AP模型［2］。具体方法为：大鼠适应性喂养1周，实验前禁食24 h，但可自由饮水，实验时剪去大鼠右下腹皮毛，以艾力克消毒，按50 μg/(kg·h)腹腔注射蛙皮素，1次/h, 4 h共5次。对照组以生理盐水代替蛙皮素，处理动物的所有步骤与AP模型相同。

    1.2.2  给药方法  CQCQD组大鼠造模成功后予CQCQD煎剂灌胃，10 ml/kg，1次/2 h。模型组和正常对照组大鼠予与CQCQD体积相同的生理盐水。所有大鼠均于造模成功后8 h取胰腺组织进行病理检查，提取胰腺组织总RNA及分离胰腺腺泡细胞检测其细胞内钙离子浓度。

    1.2.3  胰腺组织病理评分  取0.5 cm×2 cm×2 cm大小胰腺组织用10%甲醛固定，送华西医院基础与法医学院病理教研室，由一名病理医生进行苏木素?伊红（hematoxylin?eosin, HE）染色并在光学显微镜下进行病理评分。评分标准参照Zhang等［3］的标准。

    1.2.4  胰腺腺泡细胞内钙离子浓度的检测  胶原酶消化法获得胰腺腺泡细胞［1］。所得胰腺腺泡细胞加入到预先经多聚赖氨酸处理过的孔板各孔内，入37 ℃ 5% CO2培养箱孵育6 h，5 μmol/L Fluo?3?AM 37 ℃避光加载细胞30 min，洗净细胞外荧光，在LSCM下观测各孔细胞荧光强度（fluorescent intensity, FI）。每个标本随机选取视野内20个不同细胞，通过LSCM附带的荧光定量分析软件对所选定的区域进行荧光强度的定量分析，细胞内钙离子浓度用FI表示。

    1.2.5  实时荧光定量聚合酶链式反应检测  采用TRIzol试剂冰上提取胰腺组织总RNA，引物及探针由上海生物科技有限公司合成。内参基因GAPDH（产物141 bp），探针5'?FAM?ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC?TAMRA?3'，上游引物5'?CCT CAA GAT TGT CAG CAA T?3'，下游引物5'?CCA TCC ACA GTC TTC TGA GT?3'；SERCA1（产物199 bp），探针5'?FAM?TGT CCC GAG CCT TGA TCC?TAMRA?3'，上游引物5'?GGT TTG GCA GGA ACG GAA T?3'，下游引物5'?GGT GGA TTT GAT GGA GAG GAT?3'； SERCA2（产物115 bp），探针5'?FAM?CAC ACT CTT TCT GTC CTG TCG?TAMRA?3'，上游引物5'?ATG AAC CTG AAA TGG GCA AG?3'，下游引物5'?GGA ACT TTG TCA CCA ACA GCA?3'。以骨骼肌作为阳性对照。反应体系包括：10×buffer（Mg2+ free）3 μl、MgCl2（25 mmol/L）3 μl、dNTP（25 mmol/L）0.36 μl、上游引物（10 μmol/L）1 μl、下游引物（10 μmol/L）1 μl、探针或染料（10 μmol/L）1 μl、Taq酶（5 U/μl）0.3 μl、ddH2O 15.34 μl及cDNA模板5 μl。在94 ℃预变性2 min，然后94 ℃ 0 s，55 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，共45个循环。绘制扩增动力学曲线，根据动力学曲线确定每个样品管中荧光强度增加到某一特定阈值时的扩增循环数（cycle threshold, Ct）。并用REST软件基因表达率。

    1.3  统计学方法  计量资料用x±s表示，病理评分及细胞内钙离子浓度采用单因素方差分析进行两两比较；基因表达的变化用Relative Expression Software Tool软件进行分析；检验水准α=0.05。

    2  结  果

    2.1  胰腺组织病理评分及细胞内钙离子浓度  模型组大鼠胰腺组织病理评分高于正常对照组及CQCQD组（P<0.05）；CQCQD组的病理评分高于正常对照组（P<0.05）。模型组大鼠胰腺腺泡细胞内钙离子FI高于正常对照组及CQCQD组（P<0.05）；正常对照组大鼠胰腺腺泡细胞内钙离子FI与CQCQD组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

    2.2  胰腺腺泡细胞SERCA1 mRNA的表达  正常对照组、模型组及CQCQD组的胰腺腺泡细胞在199 bp处未能见到有SERCA1 mRNA的PCR产物的条带，但是阳性对照的骨骼肌的SERCA1 mRNA的PCR产物的条带在199 bp处明显可见。见图1。表1  各组大鼠胰腺组织病理评分和细胞内钙离子荧光强度

    2.3  胰腺腺泡细胞SERCA2 mRNA的表达  模型组大鼠胰腺腺泡细胞SERCA2 mRNA的表达低于正常对照组（表达率=0.536，P=0.001）；CQCQD组与模型组比较，SERCA2 mRNA的表达上调（表达率=1.803，P=0.035）。见表2和图2。表2  各组大鼠胰腺腺泡细胞中SERCA2 mRNA表达

    3  讨  论

    Ward等［4］首先在1995提出胰腺腺泡细胞内钙超载是AP发病的“扳机点”的假说。其后的研究发现，大鼠胰管内灌注CaCl2后，腺泡细胞内［Ca2+］i升高，胰腺组织随之出现水肿、坏死病理改变［5］；大鼠胆胰管逆行加压注射4.5%牛磺胆酸钠复制急性坏死性胰腺炎模型，腺泡细胞内［Ca2+］i升高［6, 7］。Mooren等［8］通过结扎胰管造成胰管梗阻复制出AP模型后，观察到腺泡细胞内出现［Ca2+］i升高，正常钙信号破坏，伴有血清胰酶水平及酶原活性增高，这些现象均被钙鳌合剂BAPTA?AM预处理阻断，因此他认为钙信号改变直接参与了实验性AP的发生。在急性水肿性AP向急性坏死性AP转变的实验过程中发现，［Ca2+］i的升高水平与血淀粉酶水平和活性以及胰腺组织病理改变程度呈正相关［9］。这些研究提示胰腺腺泡细胞钙超载不仅是引发AP的关键环节，也是促进AP的重要因素。因此近年来有学者认为胰腺腺泡钙超载在AP的发生发展中占有中心地位［10］。

    胰腺腺泡细胞内［Ca2+］i主要来源于线粒体和肌浆网等细胞内钙库，在正常生理情况下SERCA功能正常，能及时将细胞钙泵回钙库；如不能及时泵回钙库，则发生钙超载，同时细胞内升高的游离钙又作用于钙依赖性钙通道，细胞外钙内流，也进一步加重了细胞内钙超载。有报道认为在AP时钙ATP酶活性降低［11］，但是是否有其基因表达的异常尚未见报道。我们的研究发现，在AP时，SERCA2 mRNA表达下调，胰腺腺泡细胞内钙离子浓度升高。这说明AP时胰腺腺泡细胞钙超载与SERCA2 mRNA表达下调相关。

    CQCQD是由《伤寒论》阳明腑实证的经典名方——大承气汤加减化裁而来，具有通里攻下、疏肝理气、清热除湿之功效。我们先前的研究已证实其可以作用于胆碱能抗炎通路，减轻全身炎性反应综合征［12］；方中的茵陈、栀子和大黄等具有钙通道阻断剂的类似作用，其中栀子还能抑制胰腺炎时胰腺细胞膜Na+?K+?ATP酶和Ca2+?Mg2+?ATP酶活性的下降，提高膜流动性而保护膜功能［13］。我们的研究发现，在CQCQD干预后AP大鼠胰腺组织的病理评分降低，胰腺腺泡细胞内钙离子浓度降低，同时SERCA2 mRNA表达上调，这说明CQCQD可通过增强AP胰腺腺泡SERCA2 mRNA的表达，进而减缓胰腺腺泡细胞钙超载，减轻胰腺组织病变。

【】
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