升清胶囊对胆囊胆固醇结石小鼠模型生化学指标的影响
【摘要】 观察疏肝利胆中药升清胶囊对胆囊胆固醇结石小鼠生化学指标的影响。 方法：38只C57BL/6J雌性小鼠随机分为正常对照组(n=10)、模型组（n=15）和升清胶囊组(n=13)。除正常对照组外，模型组和升清胶囊组小鼠采用高脂饮食诱发法建立胆固醇结石模型。造模过程中，升清胶囊组小鼠予升清胶囊0.22 g/(kg·d)灌胃。8周后观察各组小鼠的成石率、血脂含量、血清钙离子浓度、肝脏丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量及超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性。 结果：模型组成石率为73.33%，明显高于正常对照组和升清胶囊组，差异有统计学意义（P<0.01）。升清胶囊组血清总胆固醇和低密度脂蛋白含量低于模型组（P<0.01），高密度脂蛋白含量高于模型组（P<0.01）；升清胶囊组小鼠肝脏SOD活性升高和MDA含量下降，与模型组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：升清胶囊可通过降低小鼠胆固醇结石模型成石率，改善血清和肝脏的生化学相关指标，从而发挥防治胆石病的作用。
【关键词】 升清胶囊 胆固醇结石 小鼠 胆固醇 丙二醛 超氧化物歧化酶
Zhang XL, Liang XQ, Gu HG, Ma EW, Lin TB, Sun X, Zhang JZ. J Chin Integr Med/Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao. 2008; 6(10): 1045?1048.
Received April 10, 2008; published online October 15, 2008.
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DOI: 10.3736/jcim20081011Open Access
Effects of Shengqing Capsule on biochemical parameters in mice with cholesterol gallstone
Xue?lin ZHANG1, Xiao?qiang LIANG2, Hong?gang GU1, En?wei MA1, Tian?bi LIN1, Xun SUN1, Jing?zhe ZHANG1
1. Department of Hepatobiliary Surgery, Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China
2. Institute of Chinese Traditional Surgery, Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 200032, China
Objective: To observe the effects of Shengqing Capsule (SQC), a compound of traditional Chinese herbal medicine, on biochemical parameters in C57BL/6J mice with cholesterol gallstone.
Methods: Thirty?eight C57BL/6J mice were randomly divided into normal control group (n=10), untreated group (n=15) and SQC group (n=13). Cholesterol gallstone was induced in mice of the latter two groups by feeding high cholesterol diet. Mice in the SQC group were intragastricly administered SQC 0.22 g/(kg·d). After 8?week treatment, animals were sacrificed and sampled to calculate the incidences of stone formation. The contents of serum cholesterols and Ca2+, and the malonaldehyde (MDA) content and superoxide dismutase (SOD) activity in liver tissues were detected.
Results: The incidences of stone formation were 73.33% in untreated group, 0% in normal control group, and 23.08% in the SQC group. And the incidence in untreated group was significantly higher than those in the normal control group and the SQC group (P<0.01). Contents of serum total cholesterol (TC) and low?density lipoprotein cholesterol (LDL?C) in the SQC group were lower than that in the untreated group (P<0.01), and high?density lipoprotein cholesterol (HDL?C) in the SQC group was higher than that in the untreated group (P<0.01). SQC could increase the SOD activity and decrease the MDA content in liver tissues, showing significant differences as compared with those in the untreated group (P<0.05).
Conclusion: SQC can decrease the incidence of stone formation and improve the biochemical parameters, which may be one of the mechanisms in the treatment and prevention of cholesterol gallstone disease.
Keywords: Shengqing Capsule; cholesterol gallstone; mice; cholesterol; malondialdehyde; superoxide dismutase
胆石病是一种世界范围的常见和多发疾病，其防治依然是当今医学界关心和注重的研究主题。临床上一般以手术治疗为主，但手术治疗存在适应症的限制和一定的风险，术后并发症、残留及复发结石的处理仍很棘手。因此，非手术疗法愈来愈受到重视，中医药在胆石病治疗中的优势正日显突出。本学科的前期研究工作表明，疏肝利胆方药对胆石病具有确切的临床疗效［1］，但其药效和作用机制尚不明确。为此，本研究采用C57BL/6J小鼠胆囊胆固醇结石模型，拟进一步观察疏肝利胆中药对模型小鼠相关生化学指标的影响，为胆石病中医药治疗的更加系统和规范提供实验依据。
1 材料和方法
1.1 实验动物 38只雌性C57BL/6J小鼠，10周龄，体质量（20±2）g，SPF级，由上海必凯动物实验有限公司提供，批号为SCXK(沪)2003?0002。
1.2 仪器与试剂 Mgna FTIR?750型红外光谱仪，美国Nicolet公司生产；CX31型生物显微镜，日本Olympus公司生产；AA?200DS型天平，美国G&G公司生产；Beckman J?301高速冷冻离心机，美国Beckman公司生产；WFE UV?2102 C型紫外可见分光光度计，上海Unico有限公司生产。总胆固醇（total cholesterol，TC）试剂盒，上海荣盛生物有限公司提供，批号为国食药监械(试)字2004第3060255号；低密度脂蛋白胆固醇（low?density lipoprotein cholesterol，LDL?C）和高密度脂蛋白胆固醇（high?density lipoprotein cholesterol，HDL?C）试剂盒，北京北化康泰临床试剂有限公司提供，批号分别为国食药监械（准）字2004第3061197号和国食药监械（准）字2004第3400558号；丙二醛（malondialdehyde，MDA）试剂盒、过氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）试剂盒和钙离子试剂盒，南京建成生物有限公司提供，MDA批号为20050106，SOD批号为20050108，钙离子试剂盒批号为20050107。
1.3 实验药物和致石饲料 升清胶囊（Shengqing Capsule, SQC）由生大黄、陈皮、虎杖3味中药组成，0.3 g×60粒/瓶。批号为沪药制字Z05170981，由龙华制剂室生产提供。致石饲料配方为普通啮齿科饲料中加入15%脂肪（猪油）、1%胆固醇和0.5%胆酸，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。
1.4 动物分组、造模及药物处理 将C57BL/6J小鼠体质量均衡后，按随机数字表法随机分为正常对照组（n=10）、模型组（n=15）和升清胶囊组（n=13）。造模期间不限饮食、摄水。采用高脂饮食诱发法［2］建立小鼠胆囊胆固醇结石动物模型，正常对照组小鼠喂正常饲料，模型组小鼠喂致石饲料，升清胶囊组在喂致石饲料的同时予升清胶囊灌胃。升清胶囊灌胃剂量按成人用药剂量（60 kg体质量，升清胶囊2.7 g/d）与实验动物体型系数换算法［3］，灌胃剂量为36 mg/(kg·d)，用生理盐水将升清胶囊配成144 mg/ml悬混液，1次/d灌胃。模型组及正常对照组小鼠予等体积生理盐水灌胃，连续8周后取材。期间每周称取体质量一次，用以调整给药剂量。
1.5 标本采集和制备 各组动物均于灌胃第8周末，以15%乌拉坦腹腔注射麻醉，抽血处死。肉眼观察胆汁中成石情况，然后在冰盘上迅速摘取胆囊组织和肝脏，再仔细观察胆囊内成石情况。胆囊和肝脏组织于4 ℃预冷的生理盐水中洗去余血，置－80 ℃冰箱保存备测。此外，将所抽血液在室温中静置2 h，低温离心获取血清，置于－80 ℃冰箱保存备测。
1.6 胆石红外光谱定性 采用溴化钾压片法测定胆结石样品。具体方法：均匀研细胆结石样品，取1～2 mg粉末与干燥的溴化钾粉末200 mg，在玛瑙研钵中均匀混合，然后装入压模，抽真空1～2 min，再加10 T左右的压力（同时抽真空），取出压片，放入Mgna FTIR?750型红外光谱仪的样品光路，进行测试，参比光路置放溴化钾压片。
1.7 血清及肝脏相关指标的测定 血清TC、LDL?C、HDL?C含量及肝脏MDA含量、SOD活性均采用赖氏法测定；血清Ca2＋含量采用甲基麝香草酚蓝比色法测定，具体操作按试剂盒说明书进行。
1.8 统计学方法 所有运算程序均运用SPSS 11.5统计软件包进行。计量资料用x±s表示，组间比较采用单因素方差分析；计数资料采用百分率表示，采用确切概率法比较组间差异有无统计学意义。
2 结 果
2.1 小鼠胆结石生成情况 正常对照组10只动物中均未生成胆囊结石；模型组15只小鼠中有11只生成结石，其成石率为73.33%，显著高于正常对照组（P<0.01）；升清胶囊组13只动物中有3只生成结石，其成石率为23.08%，明显低于模型组（P<0.01）。
2.2 胆结石定性 肉眼所见胆囊结石呈胆石泥砂或絮状沉淀状。经红外光谱检测分析胆结石在1 466、1 377和1 050 cm?1处有较强的胆固醇吸收峰，可确定为胆固醇型结石。
2.3 各组小鼠血脂含量和钙离子含量 模型组小鼠血清TC与LDL?C含量与正常对照组比较显著升高（P<0.01），而血清HDL?C含量较正常对照组显著下降（P<0.01）。升清胶囊组血清TC和LDL?C含量较模型组显著降低（P<0.01），而HDL?C含量高于模型组（P<0.01）。模型组、正常对照组和升清胶囊组血清Ca2+含量差异无统计学意义。见表1。表1 各组小鼠血清TC、LDL?C、HDL?C和Ca2＋含量
2.4 各组小鼠肝脏SOD活性和MDA含量 模型组小鼠肝脏SOD活性低于正常对照组（P<0.01），升清胶囊组肝脏SOD活性较模型组明显升高(P<0.05)。模型组小鼠肝脏MDA含量显著高于正常对照组（P<0.01），升清胶囊组MDA含量明显低于模型组（P<0.05）。见表2。表2 各组小鼠肝脏SOD活性和MDA含量
3 讨 论
胆石病是一种世界范围内的多发性、难治性疾病。胆石病发病也呈较快的上升趋势，部分地区患病率已达10%［4］，接近世界发达国家10%～15%的发病水平［5］。随着人口结构老龄化与饮食结构等诸多因素的改变，目前中国胆结石的患病种类以胆囊结石为主［6］，胆固醇结石已成为中国胆结石的主要发生类型［4, 7］。
根据胆石病临床症状及病理特点，一般将其归属于中医的“胁痛”、“肝胀”、“胆瘅”、“胆胀”和“黄疸”等范畴。自20世纪50年代，我们在国内较早开展了中药防治胆石病的临床与实验研究。在已故著名中医外科专家顾伯华教授、中西医结合专家徐长生教授胆石病经验的基础上，曾对274例慢性胆道感染和胆石病进行辨证分析，发现胆石病中肝胆气郁证占44.53%，予疏肝利胆法治疗有效率达86.82%［1］。升清胶囊是龙华朱培庭教授的临床验方，由大黄、虎杖和陈皮组成，具有清除湿热、行气活血、缓下通便、健脾和中之功效。药理研究表明，该药物成分在肝脏和胆囊有明显的药理作用。如大黄能疏通肝内毛细胆管，促进胆汁分泌，改善胆小管内胆汁淤积，同时可以促进胆囊收缩，松弛胆囊奥狄氏括约肌，增加胆汁排出量；虎杖可以改善肝组织微循环，促进肝细胞再生和提高修复损伤的能力；陈皮具有利胆作用，陈皮挥发油还兼有溶石作用［8］。
20世纪60年代以来，围绕胆结石形成的原因和发病机制，研究主要集中在诸如胆汁热力学平衡体系、胆道运动体系、成核活性蛋白体系、胆石形成的细菌学说及基因学说等方面。目前一致公认，胆固醇代谢障碍与胆固醇结石形成的关系密切，是结石形成的重要条件［9］。本研究发现，升清胶囊可以降低胆石病小鼠血清TC及LDL?C含量（P＜0.01），增加HDL?C含量（P＜0.01），与上述理论吻合。
SOD是含有金属离子的生物活性酶，是生物体内自由基的重要清除酶之一，在维持正常生物体代谢过程中发挥重要作用。SOD活性降低，体内自由基清除减少，导致胆道黏膜上皮细胞和亚细胞结构的破坏和功能的扰乱，造成胆囊黏膜黏蛋白分泌增多；自由基的增多还可引起胆固醇或胆色素溶解体系热力学平衡的紊乱，并同时诱发胆红素的聚合和聚集，参与成核作用，形成“致石胆汁”；自由基还可诱导肝细胞损伤，引起肝细胞分泌功能的紊乱，最后在多因素的共同作用下形成胆色素结石［10?12］。本研究发现，胆固醇结石模型组小鼠肝脏中SOD活性显著降低(P<0.01)，而升清胶囊组SOD活性较模型组显著升高(P<0.05)，这说明不仅是胆色素结石，胆固醇结石模型中的SOD也显著降低，升清胶囊可以通过升高肝脏中SOD活性起到逆转成石胆汁的作用。
MDA是脂质过氧化反应的终末产物，过氧化脂质是饱和脂肪酸经自由基作用所形成的过氧化物。氧自由基和过氧化脂质能破坏生物膜和损害细胞的功能，使胆囊黏膜细胞受损，炎症发生，进而加速结石形成［13］。本研究中模型组小鼠肝脏中MDA的水平显著升高(P<0.01)，升清胶囊组MDA水平较模型组显著降低（P<0.05），说明升清胶囊可以降低MDA含量，进而保护胆囊黏膜细胞发挥逆转成石胆汁的作用。
此外，本研究发现升清胶囊对胆固醇结石动物血清中Ca2＋含量的影响无统计学意义，这与中相关报道所显示的Ca2＋变化可能与胆色素结石形成相关性更大是一致的［14, 15］。今后就这方面还需做更多的研究，加以进一步证实。
【文献】
1 Zhu PT, Zhang JZ, Cao ZP, et al. Summary of the treatment of 274 patients with chronic biliary tract infection and cholelithiasis. Shanghai Zhong Yi Yao Za Zhi. 1986; 20(9): 15?17. Chinese.
朱培庭, 张静喆, 曹中平, 等. 治疗慢性胆道感染、胆石病274例的总结. 上海中医药杂志. 1986; 20(9): 15?17.
2 Zhu PT, Zhu SM. Practice of traditional Chinese medicine for cholic diseases. Beijing: People's Medical Publishing House. 1999: 272. Chinese.
朱培庭, 朱世敏. 实用中医胆病学. 北京: 人民卫生出版社. 1999: 272.
3 Chen Q. The experimental methods of traditional Chinese medicinal pharmacology. Beijing: People's Medical Publishing House. 1994: 206?231. Chinese.
陈奇. 中药药理实验方法学. 北京: 人民卫生出版社. 1994: 206?231.
4 Chen XG, Liu JQ, Peng MH, et al. Intrahepatic cholelithiasis in Guangxi area, an analysis of 8 585 cases. Zhonghua Pu Tong Wai Ke Za Zhi. 2002; 17(2): 99?101. Chinese with abstract in English.
陈希纲, 刘家奇, 彭民浩, 等. 胆石病临床流行病学调查——附8 585例分析. 中华普通外科杂志. 2002; 17 (2): 99?101.
5 Glass CK, Witztum JL. Atherosclerosis: the road ahead. Cell. 2001; 104(4): 503?516.
6 Huang ZQ. Status quo and future prospects of biliary tract surgery. Zhongguo Shi Yong Wai Ke Za Zhi. 1999; 19(1): 17?18. Chinese.
黄志强. 胆道外科的现状与未来. 中国实用外科杂志. 1999; 19(1): 17?18.
7 Shi JS, Ren Y. Progress of experimental study on biliary tract surgery in China. Zhonghua Shi Yan Wai Ke Za Zhi. 2004; 21(12): 1418?1419. Chinese.
石景生, 任予. 我国胆道外科实验研究的进展. 中华实验外科杂志. 2004; 21(12): 1418?1419.
8 Hou JY. Pharmacology of traditional Chinese medicine. Beijing: China Press of Traditional Chinese Medicine. 2002: 120?231. Chinese.
侯家玉. 中药药. 北京: 中国中医药出版社. 2002: 120?231.
9 Bie P, Fan YD. Advances in pathogenesis of cholelithiasis. Zhongguo Pu Wai Ji Chu Yu Lin Chuang Za Zhi. 2003; 10(5): 439?441. Chinese.
别平, 范毓东. 胆囊结石发病机理的研究进展. 中国普外基础与临床杂志. 2003; 10(5): 439?441.
10 Geetha A. Evidence for oxidative stress in the gall bladder mucosa of gall stone patients. J Biochem Mol Biol Biophys. 2002; 6(6): 427?432.
11 Abu?Hilal M, McPhail MJ, Marchand L, et al. Malondialdehyde and superoxide dismutase as potential markers of severity in acute pancreatitis. JOP. 2006; 7(2): 185?192.
12 Xiao ZL, Amaral J, Biancani P. Impaired cytoprotective function of muscle in human gallbladders with cholesterol stones. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2005; 288(3): G525?G532.
13 Sipos P, Krisztina H, Bl?zovics A, et al. Cholecystitis, gallstones and free radical reactions in human gallbladder. Med Sci Monit. 2001; 7(1): 84?88.
14 Zhang XB, Cui NQ, Li DH. Dynamic experimental study on unconjugated bilirubin, calcium ion and total bile acid contents in pigment gallstone model bile. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Wai Ke Za Zhi. 2007; 13(1): 17?20. Chinese with abstract in English.
张西波, 崔乃强, 李东华. 胆色素结石模型胆汁中UCB、TBA、Ca2+的动态实验研究. 中国中西医结合外科杂志. 2007; 13(1): 17?20.
15 Pundir CS, Rani K, Garg P, et al. Correlation between chemical composition of biliary calculi and sera of stone formers. Indian J Med Sci. 2002; 56(8): 373?375.
