蒲黄总黄酮对3T3?L1脂肪细胞过氧化物酶体增生物激活受体家族mRNA基因表达的影响

【摘要】  观察蒲黄总黄酮（Pollen Typhae total flavones, PTF）对脂肪细胞糖脂代谢和过氧化物酶体增生物激活受体（peroxisome proliferator?activated receptor, PPAR）家族基因表达的影响，并分析其改善胰岛素抵抗的可能机制。方法：蒲黄总黄酮干预3T3?L1脂肪细胞，实时定量荧光多聚酶联反应检测脂肪细胞分化相关基因PPAR家族，包括PPARα、PPARγ和PPARβ/δ mRNA的表达。结果：蒲黄总黄酮可上调PPARα、PPARγ mRNA的表达，下调PPARβ/δ mRNA的表达，与正常对照组比较，差异有统计学意义（P<0.01）。结论：蒲黄总黄酮可能通过提高3T3?L1脂肪细胞PPARα和PPARγ mRNA的表达改善胰岛素抵抗。

【关键词】  脂肪细胞 蒲黄总黄酮 游离脂肪酸 PPAR家族

    Objective: To explore the effects of Pollen Typhae total flavones (PTF) on the mRNA expressions of peroxisome proliferator?activated receptors (PPARs) α, γ, β/δ so as to analyze its possible mechanism in improving the insulin sensitivity of 3T3?L1 adipocytes.

    Methods: Adipocytes were treated with PTF, and expressions of PPARα、PPARγ、PPARβ/δ mRNAs relating to the adipocyte glucose and lipid metabolism were determined by reverse transcription polymerase chain reaction.

    Results: PTF obviously up?regulated the expressions of PPARα and PPARγ mRNAs, all showing significant differences as compared with those in the normal control group (P<0.01).

    Conclusion: With its function as an insulin sensitizer, PTF may enhance the PPARα and PPARγ mRNA expressions in 3T3?L1 adipocytes.

    Keywords: 3T3?L1 adipocyte; Pollen Typhae total flavones; free fatty acid; peroxisome proliferator?activated receptors

    游离脂肪酸（free fatty acid, FFA）的溢出是早期胰岛素抵抗及其靶器官代谢异常的中心环节之一，也是近年来代谢领域研究的重点［1］。脂肪组织是机体能量调节器官，其脂肪代谢及糖代谢的异常在早期胰岛素抵抗发生中起着极其重要的作用。蒲黄是调节血脂的常用中药，对胰岛素抵抗亦有改善作用［2］。在临床上广泛应用于糖脂代谢异常的患者。本研究所在前期的细胞学实验中也发现蒲黄的有效成分蒲黄总黄酮（Pollen Typhae total flavones, PTF）可改善成熟脂肪细胞的葡萄糖消耗和游离脂肪酸的溢出［3］。本次研究通过观察蒲黄总黄酮对3T3?L1脂肪细胞过氧化物酶体增生物激活受体（peroxisome proliferator?activated receptor, PPAR）家族基因表达的影响，进一步探讨蒲黄总黄酮改善胰岛素抵抗的机制。

    1  材料与方法

    1.1  药物和试剂  罗格列酮（rosiglitazone，ROS）由浙江天马制药有限公司提供；蒲黄总黄酮由上海信谊药业有限公司提供；达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM）和TRIzol由GIBCO公司提供；地塞米松、异丁基?甲基?黄嘌呤和胰岛素购自Sigma公司；油红O购自Sigma公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA)为Sino?American Biotech公司产品；逆转录酶AMV第一链cDNA合成试剂盒为Bio?Basic公司产品；聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）扩增试剂盒购自Invitrogen公司。

    1.2  细胞培养及分组  3T3?L1细胞株购自America Type Culture Collection公司，其培养与诱导分化方法同［4］。将3T3?L1前脂肪细胞接种于培养板，用含10%小牛血清的高糖DMEM培养，待细胞融合2 d后，加含0.5 mmol/L异丁基?甲基?黄嘌呤、0.25 nmol/L地塞米松和10 μg/ml胰岛素的10%胎牛血清高糖DMEM培养48 h，换以含10 μg/ml胰岛素的含10%胎牛血清培养液再培养48 h，随后以10%胎牛血清高糖DMEM继续培养，2 d换培养液1次，诱导分化8～12 d，3T3?L1细胞90%呈脂肪细胞表型［1］。将24孔培养板中分化成熟的脂肪细胞以含0.2% BSA的DMEM培养基培养12 h后，分为空白对照组（不加药）、蒲黄总黄酮组（0.2 g/L）和罗格列酮组（5 μmol/L），药物均使用去离子水配置，药物干预培养24 h。

    1.3  PPAR mRNA表达  采用实时定量PCR法检测。药物处理同上，抽提细胞总RNA，以AMV第一链cDNA合成试剂盒逆转录为cDNA。上下游引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PPARγ上游引物：5'?TTT CAA GGG TGC CAG TTT CG?3'；下游引物：5'?GGG AGG CCA GCA TCG TGT A?3'。PPARα上游引物：5'?TAC GGC AAT GGC TTT ATC AC?3'；下游引物：5'?CCC TCC TGC AAC TTC TCA AT?3'。PPARβ/δ上游引物：5'?TGC GGC AAC GTG AAA GGA AT?3'；下游引物：5'?ACG CGG TAT CCA CGT CAA GTA?3'。看家基因甘油醛?3?磷酸脱氢酶（glyceraldehyde?3?phosphate dehydrogenase, GAPDH）上游引物：5'?AAG GTC GGA GTC AAC GGA TT?3'；下游引物：5'?CTG GAA GAT GGT GAT GGG ATT?3'。参照试剂盒说明书，反应体系为25 μl，内含5×PCR Buffer 5.0 μl，Mg2+ 0.3 μl，dNTP 0.75 μl，引物1.0 μl，25×SYBR GreenⅠ1.0 μl，校准液 1.0 μl，Ex?Taq酶0.25 μl，ddH2O 14.7 μl，模板1.0 μl。实时定量PCR反应在Cotbett Roto?Gene 3000实时定量PCR仪中进行。反应程序为：95 ℃预变性10 s，60 ℃ (GAPDH)退火30 s，55 ℃延伸10 s，共80个循环，每个循环结束后采集荧光信号。最后绘溶解曲线以确定反应产物无引物二聚体及非特异性扩增。当荧光信号强度超过基线时，其域值循环数（cycle threshold，Ct）被记录下来。在实时定量PCR中，Ct值被认为与被扩增基因的初始浓度密切相关。扩增后根据Ct值及标准曲线出目的基因拷贝数与106 GAPDH的相对值。

    1.4  统计学方法  采用SPSS 11.0 for Windows统计软件对实验结果进行统计分析，组间比较采用单因素方差分析，计量资料数据用x±s表示。

    2  结  果

    蒲黄总黄酮组3T3?L1细胞PPARα、PPARγ mRNA表达量均明显高于正常对照组，差异有统计学意义（P<0.01），但低于罗格列酮组，差异亦有统计学意义（P<0.01）。蒲黄总黄酮组3T3?L1细胞PPARβ/δ mRNA表达量低于正常对照组和罗格列酮组（P<0.01）。见表1。表1  3T3?L1脂肪细胞PPARα、PPARγ和PPARβ/δ mRNA表达

    3  讨  论

    脂肪代谢的改变及其对糖代谢异常的影响在早期胰岛素抵抗的中心作用一直是国内外研究的热点。研究药物对脂肪细胞糖脂代谢的影响，对于防治与胰岛素抵抗密切相关的2型糖尿病、血脂异常、脂肪肝和动脉粥样硬化等代谢性疾病的发病及减轻其危害具有重要意义。近年来FFA在胰岛素抵抗的发生发展中的核心作用正成为倍受关注的研究热点。前期研究已经证实，蒲黄总黄酮可直接抑制成熟3T3?L1脂肪细胞FFA的外溢，同时可改善脂肪细胞对葡萄糖的摄取和利用，提示蒲黄总黄酮可改善脂肪及葡萄糖代谢，由此对胰岛素抵抗特别是早期胰岛素抵抗有一定的改善作用［3］。

    PPARs属激素核受体超家族成员，由PPARα、PPARγ、PPARβ/δ 3个亚型组成。其中，PPARα在脂质代谢中起着关键的调节作用［5］。PPARα活化可以调节与脂肪酸氧化有关的基因的转录，参与脂质代谢、能量动态平衡和胰岛素敏感性等生物学过程的调节等。PPARγ最具脂肪组织特异性，对脂肪细胞的分化起着重要作用［6］，并在一定程度上抑制脂肪组织分泌TNF?α等脂肪细胞因子，有利于改善胰岛素抵抗［7］。PPARβ/δ近年才受到广泛关注，也被发现与脂肪生成和脂质代谢调节有密切关系［8］。大量研究表明，PPARs的调节剂有望成为2型糖尿病、肥胖、高脂血症和动脉粥样硬化等疾病的药物。PPARα的激动剂贝丁酸和PPARγ的激动剂噻唑烷二酮类（thiazolidinediones, TZD）药物，已被临床成功用作降脂药和胰岛素增敏剂。PPARβ/δ的激动剂可能会通过对骨骼肌的作用而成为另一个新型胰岛素增敏及降脂药物。因为3种PPAR亚型在代谢综合征的发病中作用不完全相同，所以近来的研究集中于开发一种全新的药物，使其要么具有更高的选择性，要么具有两个或全部PPAR活化特性。PPARα/PPARγ激动剂tesaglitazar就被认为可改善脂肪餐后的糖脂代谢［9］。

    TZD类药物罗格列酮是目前治疗胰岛素抵抗的代表药物，它促进PPARγ表达增加和脂肪细胞的分化，促进葡萄糖转运，增加脂肪组织胰岛素敏感性，但却有肥胖等脂质积聚的副作用［6］。我们的实验结果表明蒲黄总黄酮可提高PPARα和PPARγ mRNA的表达，说明它能在一定程度上改善胰岛素抵抗引起的糖脂代谢紊乱。而且蒲黄总黄酮促进脂肪细胞的分化，促进PPARγ mRNA表达的效应与PPARγ激动剂罗格列酮相似，但PPARγ mRNA的上升幅度却小于罗格列酮，说明其在脂肪细胞的积聚这一副作用可能小于罗格列酮。这对临床选择治疗胰岛素抵抗中药有一定的指导作用。

    但蒲黄总黄酮改善胰岛素敏感性的确切机制及能量的去处尚有待于深入研究。而且，在体内的作用与离体的作用并不完全相同，会受到其他因素的影响，因此进一步研究蒲黄总黄酮改善胰岛素抵抗的机制，探究其在体内的作用及影响因素是一项颇具意义的工作。

【】
  1 Wilding JP. The importance of free fatty acids in the development of Type 2 diabetes. Diabet Med. 2007; 24(9): 934?945.

2 Wang HB, Wang ZY. The research development on the pharmacological function of Pollen Typhae. Yi Yao Dao Bao. 2005; 24 (4): 318?319. Chinese.

王海波, 王章元. 蒲黄药理作用的研究进展. 医药导报. 2005; 24(4): 318?319.

3 He YM, Wang WJ, Chen WH, et al. Effects of Pollen Typhae total flavone on glucose and lipid metabolism in 3T3?L1 adipocytes. Zhong Xi Yi Jie He Xue Bao. 2006; 4(6): 593?595. Chinese with abstract in English.

何燕铭, 王文健, 陈伟华, 等. 蒲黄总黄酮对3T3?L1脂肪细胞糖脂代谢的影响. 中西医结合学报. 2006; 4(6): 593?595.

4 Takano A, Haruta T, Iwata M, et al. Growth hormone induces cellular insulin resistance by uncoupling phosphatidylinositol 3?kinase and its downstream signals in 3T3?L1 adipocytes. Diabetes. 2001; 50(8): 1891?1900.

5 Duval C, Müller M, Kersten S. PPARalpha and dyslipidemia. Biochim Biophys Acta. 2007; 1771(8): 961?971.

6 Chou FS, Wang PS, Kulp S. Effects of thiazolidinediones on differentiation, proliferation, and apoptosis. Mol Cancer Res. 2007; 5(6): 523?530.

7 Pfützner A, Weber MM, Forst T. Pioglitazone: update on an oral antidiabetic drug with antiatherosclerotic effects. Expert Opin Pharmacother. 2007; 8(12): 1985?1998.

8 Jucker BM, Yang D, Casey WM, et al. Selective PPAR (delta) agonist treatment increases skeletal muscle lipid metabolism without altering mitochondrial energy coupling: an in vivo magnetic resonance spectroscopy study. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2007; 293(5): E1256?E1264.

9 Fagerberg B, Schuster H, Birketvedt GS, et al. Improvement of postprandial lipid handling and glucose tolerance in a non?diabetic population by the dual PPAR alpha/gamma agonist, tesaglitazar. Diab Vasc Dis Res. 2007; 4(3): 174?180.