汉防己甲素对白血病耐药细胞株K562/A02核因子κB表达的影响

【摘要】  通过研究汉防己甲素（tetrandrine, Tet）对白血病细胞株K562及其耐药细胞株K562/A02核因子κB（nuclear factor?kappaB，NF?κB）表达的影响，探讨Tet逆转多药耐药的作用机制。方法：采用免疫细胞化学及蛋白印迹法分别检测1 μmol/L Tet作用K562和K562/A02细胞6 h和12 h后，细胞NF?κB核转位水平和胞核NF?κB蛋白表达的变化。结果：Tet作用6 h和12 h后，对K562细胞的NF?κB核转位水平及胞核NF?κB蛋白表达均无明显影响(P>0.05)；K562/A02细胞NF?κB核转位水平及胞核NF?κB蛋白表达明显高于K562细胞对照组(P<0.01)；Tet作用6 h和12 h后，可明显降低K562/A02细胞NF?κB蛋白核转位(P<0.05)和胞核NF?κB蛋白表达水平（P<0.01)，作用12 h较作用6 h效果更显著(P<0.05)。结论：1 μmol/L Tet可能通过抑制NF?κB活化逆转K562/A02细胞多药耐药性。

【关键词】  白血病 多药耐药 防己甲素 核因子κB

    Objective: To investigate the effects of tetrandrine (Tet) on nuclear factor kappaB (NF?κB) expression in leukemia cell line K562 and multidrug?resistant K562/A02 cell line.

    Methods: The activations of NF?κB in K562 and K562/A02 cells and the effects of 1 μmol/L Tet on NF?κB expression were determined by immunocytochemistry and Western blot assay.

    Results: Tet had no effect on NF?κB expression in K562 cells after 6? and 12?hour treatment (P>0.05), and K562/A02 cells displayed higher level of NF?κB protein expression than their parental K562 cells (P<0.01). Tet could significantly down?regulate NF?κB protein expression and nuclear translocation in K562/A02 cells shown by immunocytochemistry and Western blot, and this decrease became more significant after 12?hour treatment than after at 6?hour treatment (P<0.05).

    Conclusion: Activation of NF?κB may be related to multidrug resistance of K562/A02 cell line. And the inhibition of NF?κB activation by Tet leads to multidrug resistance reversal in K562/A02 cell line.

    Keywords: leukemia; multidrug resistance; tetrandrine; nuclear factor kappaB

    肿瘤耐药是当今肿瘤的一大难题，一直是国内外研究的热点。肿瘤耐药的发生是多种机制共同作用的结果，其机制之一是调节细胞凋亡相关因子导致凋亡抵抗，如活化NF?κB、Bcl?2、突变型p53等［1］。克服和干预肿瘤细胞耐药是提高肿瘤疗效的重要手段。中药汉防己科植物粉防己具有行水和泻下焦湿热的功效，用于治疗水肿臌胀、湿热脚气、手足痉挛等［2］。汉防己甲素（tetrandrine, Tet）是从粉防己块根中提取的生物碱，研究证实Tet是天然的非选择性钙通道阻滞剂，又是钙调蛋白拮抗剂，临床用于逆转多药耐药（multiple drug resistance, MDR）时耐受性较好，无明显副作用［3?5］。核因子κB（nuclear factor?kappaB，NF?κB）是分布和作用十分广泛的真核细胞转录调控因子，其与肿瘤发生、浸润转移以及肿瘤多药耐药有密切关系，可能成为提高肿瘤化疗效果的治疗新靶点［6］。

    本课题组既往的实验已证实，Tet能有效逆转慢性粒细胞白血病急性红白血病变细胞耐药株K562/A02对化疗药物柔红霉素的耐药性；它逆转耐药可能与下调mdr1基因及P?糖蛋白（P?glycoprotein, P?gp）的表达，改变细胞内钙离子浓度［Ca2＋］i，下调bcr/abl基因等有关［7, 8］。为进一步了解该药逆转耐药的作用机制，本实验将检测Tet对NF?κB表达的影响，为该药作为耐药逆转剂应用于临床提供理论依据。

    1  材料与方法

    1.1  细胞株及来源  人慢性粒细胞白血病急性红白血病变细胞株K562购自院上海细胞生物学研究所。人慢性粒细胞白血病急性红白血病变阿霉素（adriamycin, ADM）耐药细胞株K562/A02购自中国医学科学院血液病研究所。

    1.2  主要仪器及试剂  免疫组化SP检测试剂盒，为北京中山生物技术有限公司产品；蛋白提取试剂盒为Active Motif公司产品；蛋白质定量测定试剂盒为Pierce公司产品；Western blot试剂盒为KPL公司产品；中分子量标准蛋白质为Fermentas Life Science公司产品；β?actin为Amresco公司产品；抗NF?κB p65抗体（产品货号：sc?8008, sc?372）及辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG均为Santa Cruz公司产品。图像分析处理系统：ImageMaster VDS图像分析仪、ImageMaster 2D Platinum 5.0软件为Pharmacia公司产品。所有操作均按试剂盒说明书提供的方法进行。Tet注射液，30 mg/支（2 ml）为浙江康恩贝集团金华制药厂产品。

    1.3  细胞培养及实验分组  K562细胞用含10%小牛血清的RPMI 1640培养液培养，K562/A02细胞在含10％小牛血清、1 μmol/L ADM的RPMI 1640培养液中培养，置于37 ℃、5% CO2培养箱中，每天换液，2～3 d传代一次。实验时取对数生长期细胞，用无血清RPMI 1640培养液静置6 h后，计数活细胞数，活细胞数90％以上时进行分组及干预，细胞密度按不同实验要求调整，实验重复3次。K562细胞和K562/A02细胞分别分组，即分为K562细胞对照组、K562细胞Tet 6 h组、K562细胞Tet 12 h组和K562/A02细胞对照组、K562/A02细胞Tet 6 h组、K562/A02细胞Tet 12 h组。本实验所采用的各药物剂量均系本课题组既往实验通过MTT法半数抑制浓度（50% inhibiting concentration, IC50）所得，其中1 μmol/L Tet为最佳有效逆转浓度，该浓度无细胞毒作用，用于实验。

    1.4  NF?κB核转位免疫细胞化学染色及结果判断  操作按试剂盒说明书提供的方法进行，3?氨基?9?乙基咔唑（3?amino?9?ethylcarbazole, AEC）显色，PBS代替一抗作为阴性对照，以细胞核有红色颗粒者为阳性细胞，镜下随机选取5个高倍视野，计数500个细胞，计算胞核染色的阳性细胞占细胞总数的百分比。

    1.5  Western blot检测NF?κB  操作按试剂盒说明书提供的方法进行，以BCIP/NBT显色，待出现清晰的蛋白条带时，终止显色反应。扫描滤膜并对电泳条带进行光密度分析。以65 ku处NF?κB蛋白条带与β?actin条带的比值作为各组实验数据，每组实验重复3次。

    1.6  统计学方法  数据资料用x±s表示，用SPSS 11.0统计软件对数据进行统计分析，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD?t检验。

    2  结  果

    2.1  免疫细胞化学测定Tet对细胞NF?κB蛋白核转位的影响

    2.1.1  Tet作用于K562细胞后免疫细胞化学结果  镜下可见，K562细胞对照组细胞的胞浆、胞核均无着色，其余各组K562细胞胞浆均可见红色颗粒沉淀，活化的细胞NF?κB发生转位进入胞核，胞核也可见红色颗粒沉淀。Tet作用于K562细胞6 h和12 h后，细胞胞核NF?κB阳性率分别为（37.39±0.95）%和（40.81±0.79）%，与K562细胞对照组（39.64±0.92）%相比，差异无统计学意义（P>0.05）。

    2.1.2  Tet作用于K562/A02细胞后免疫细胞化学结果  K562/A02细胞对照组NF?κB阳性细胞百分率为（65.03±4.18）%，与K562细胞对照组相比，差异有统计学意义（P<0.01）。与K562/A02细胞对照组比较，Tet作用于K562/A02细胞6 h和12 h后，NF?κB阳性细胞百分率均明显减少，分别为（52.65±1.12）%（P<0.05）和（45.89±2.04）%（P<0.01）。Tet作用于K562/A02细胞12 h的阳性细胞百分率低于作用6 h组（P<0.05）。

    2.2  Western blot测定Tet对细胞NF?κB蛋白表达的影响

    2.2.1  Tet作用于K562细胞后胞核NF?κB蛋白表达  Tet作用于K562细胞6 h和12 h后，NF?κB蛋白条带与β?actin条带的比值分别为2.260±0.073和2.299±0.021，与K562对照组（2.366±0.241）相比差异无统计学意义（P>0.05）。

    2.2.2  Tet作用于K562/A02细胞后6 h胞核NF?κB蛋白表达  各组NF?κB蛋白条带与β?actin条带的比值分别为：K562/A02细胞对照组3.545±0.219、K562细胞对照组2.366±0.241、K562/A02细胞Tet 6 h组2.528±0.196（图1A）。K562/A02细胞胞核NF?κB蛋白表达水平明显高于K562细胞（P<0.01）；Tet作用于K562/A02细胞6 h后，胞核NF?κB蛋白表达水平明显低于K562/A02细胞对照组（P<0.05）。

    2.2.3  Tet作用于K562/A02细胞12 h胞核NF?κB蛋白表达  各组NF?κB蛋白条带与β?actin条带密度的比值分别为：K562/A02细胞对照组3.545±0.219、K562细胞对照组2.366±0.241、K562/A02细胞Tet 12 h组2.301±0.174（图1B）。Tet作用于K562/A02细胞12 h后，胞核NF?κB蛋白表达水平明显低于对照组（P<0.01），与作用6 h相比，降低更明显（P<0.05）。

    3  讨  论

    体内外实验已证实Tet逆转耐药作用［3?5］，但作用机制不清是限制其临床应用的最大障碍，Tet逆转耐药机制是否与调节NF?κB活性相关尚无报道。本研究表明K562/A02细胞NF?κB表达水平高于K562细胞，Tet可降低K562/A02细胞NF?κB蛋白表达。

    K562及K562/A02细胞均存在NF?κB活化，且K562/A02细胞NF?κB活化高于K562细胞，提示NF?κB活化与肿瘤发生及多药耐药形成有关，与近年国内外的相关报道一致［6］。Yeh等［9］用低剂量阿霉素诱导宫颈癌SiHa细胞的耐药性，发现诱导耐药的细胞SiHa/DR的NF?κB活性明显增加，并且抑制NF?κB活性后，其耐药性明显减弱，提示化疗药诱导的NF?κB活化是耐药发生机制之一。Chuang等［10］研究多个肿瘤细胞株的NF?κB活性，发现不同细胞的NF?κB活性主要与其耐药性相关。

    Tet是否对K562和K562/A02细胞NF?κB活性有影响未见报道。Chen等［11］用不同浓度的Tet与脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）或佛波醇酯（phorbol myristate acetate, PMA）共同作用于鼠巨噬细胞NR8383，发现Tet可抑制LPS或PMA诱导的NF?κB活化，并呈剂量依赖性。Tet降低K562/A02细胞NF?κB活性的机制不明。研究证实，Tet是一种钙通道阻滞剂和抗氧化剂，而钙通道路径和细胞的氧化还原在NF?κB活化中均起重要作用，Tet抑制NF?κB活性可能与干扰钙通道和（或）影响细胞的氧化还原状态有关［3］。

    研究表明，抑制NF?κB活性可增加肿瘤细胞对化疗的敏感性［12, 13］。史剑慧等［14］发现高三尖杉酯碱0.5 μmol/L可明显诱导K562细胞NF?κB活化，地塞米松1 μmol/L和长春新碱0.1 μmol/L均能显著抑制高三尖杉酯碱诱导的NF?κB活化，并增强其诱导K562?n细胞凋亡的作用。

    抑制NF?κB活性，国外常用的方法是将ser32/36或lys21/22位突变的IκB导入肿瘤细胞，或者给予蛋白酶抑制剂使NF?κB活化受阻，从而增加肿瘤细胞对化疗的敏感性［15］。寻找安全有效的NF?κB活化抑制剂对于克服肿瘤耐药具有重要意义，Tet可抑制K562/A02细胞NF?κB活性，不仅为其逆转耐药提供了理论依据，也为肿瘤耐药的研究提供了思路。

【】
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