祛瘀解毒颗粒对子宫内膜异位症大鼠卵巢颗粒细胞肿瘤坏死因子α和白细胞介素6 mRNA表达的影响

【摘要】  观察祛瘀解毒颗粒对子宫内膜异位症（endometriosis, EM）模型大鼠卵细胞质量及卵巢颗粒细胞肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor?alpha, TNF?α）和白细胞介素6（interleukin?6, IL?6）mRNA表达的影响。方法：40例EM模型大鼠随机分为实验组（给予祛瘀解毒方颗粒）和对照组（给予生理盐水）各20例，另取20只大鼠只牵拉子宫作为假手术组，观察优质卵细胞数目及优质卵细胞率，采用逆转录?聚合酶链式反应（reverse transcription?polymerase chain reaction, RT?PCR）检测3组颗粒细胞TNF?α和IL?6的mRNA表达。 结果：实验组优质卵细胞数目和优质卵细胞率明显高于对照组（P<0.05），而实验组颗粒细胞TNF?α和IL?6 mRNA表达又明显低于对照组（P<0.05）。 结论：EM模型大鼠卵巢颗粒细胞TNF?α和IL?6 mRNA表达升高，祛瘀解毒方可能通过降低TNF?α和IL?6水平提高卵细胞的质量。

【关键词】  子宫内膜异位症 祛瘀解毒颗粒 卵巢 粒层细胞 肿瘤坏死因子α 白细胞介素6 大鼠

    Objective: To observe the effects of Quyu Jiedu Granule, a compound traditional Chinese herbal medicine for removing blood stasis and expelling superficial evils, on the quality of oocytes and the expressions of tumor necrosis factor?alpha (TNF?α)and interleukin?6 (IL?6) mRNAs in ovarian granulosa cells of endometriosis (EM) rats.

    Methods: Forty EM rats were randomly divided into two groups: experimental group and control group. There were 20 EM rats in each group. The uteri of another 20 SD rats were drawn in sham?operated group. The number and percentage of high quality oocytes and the levels of TNF?α and IL?6 mRNA expressions in the granulosa cells of EM rats were detected by using reverse transcription?polymerase chain reaction.

    Results: The number and percentage of high quality oocytes in the experimental group were significantly higher than those in the control group (P<0.05), and the levels of TNF?α and IL?6 mRNAs in granulose cells in the experimental group were significantly lower than those in the control group (P<0.05).

    Conclusion: The increase of the TNF?α and IL?6 mRNA expressions in ovarian granulose cells of EM rats leads to the decrease of the oocyte quality. The mechanism of Quyu Jiedu Granule in improving the quality of oocytes may be related to the decrease of TNF?α and IL?6 mRNA expressions in ovarian granulosa cells.

    Keywords: endometriosis; Quyu Jiedu Granule; ovary; granulosa cells; tumor necrosis factor?alpha; interleukin?6; rats

    生育年龄妇女子宫内膜异位症（endometriosis, EM）的发生率约5%～10%，50%的EM患者合并不育，严重影响生活质量［1］。EM引起不孕的机制可能与多种原因有关，如卵泡生成受损，尤其在中、重度EM中，低质量的卵母细胞可降低受精率，最终降低胚胎质量［2］。本研究通过观察EM模型大鼠优质卵细胞数目及优质卵细胞率，检测卵巢颗粒细胞中肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor?alpha, TNF?α）和白细胞介素6（interleukin?6, IL?6）mRNA表达，探讨祛瘀解毒中药对EM大鼠卵细胞质量及其生存内环境的影响。

    1  材料与方法

    1.1  实验动物  清洁级性成熟雌性SD大鼠70只，体质量（150±20）g，由山东中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号为SCXK（鲁）20050015。正常饲养，自由饮水取食，饲养室的温度保持在（20±1）℃，相对湿度约50%，自动控制光照12 h，黑暗12 h。

    1.2  实验用药  祛瘀解毒方颗粒（免煎颗粒），每袋装71 g（相当于生药量71 g），江苏省江阴天江药业有限公司提供（生产批号为0309125）。药物组成：红藤15 g、玫瑰花6 g、金银花10 g、连翘10 g、丹参10 g、赤芍10 g、丹皮10 g。

    1.3  试剂和仪器  注射用青霉素，由华北制药股份有限公司生产，批号为国药准字H13020655；人绝经期促性腺激素（human menopausal gonadotropin, HMG），由丽珠集团丽珠制药厂生产，批号为061204A；绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin, HCG），由丽珠集团丽珠制药厂生产，批号为070102；透明质酸酶，In Vitro Care公司，生产批号为r2c13。

    倒置显微镜（OLYMPAS CK40?32ph）、逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction, RT?PCR）所用试剂盒（美国Promega公司）、PTC?150型PCR扩增仪（美国MJ Research公司）和1 D Image Analysis Software凝胶分析系统（美国Kodak公司）。

    1.4  EM动物模型的建立、分组和用药  ［3］制备EM大鼠模型。麻醉大鼠，于腹中线耻骨联合上1 cm处做一2～3 cm长的纵形切口，切取左侧子宫置于PBS液中去除周围脂肪，将子宫切成小块，分别缝至肠系膜和子宫卵巢韧带上。假手术组20只大鼠只牵拉子宫。术毕腹腔注射青霉素20万U。术后3周剖腹观察，造膜成功者异位病灶处见透明的结节状或囊状隆起，囊内充满清亮的液体，移植物被结缔组织覆盖，并有血管形成［3］。取40只造膜成功大鼠随机分为实验组和对照组，每组20只。实验组予祛瘀解毒方颗粒1.6 g［4］溶入2 ml生理盐水中灌胃，对照组及假手术组予2 ml生理盐水灌胃，1次/d，各组共灌胃3周。

    1.5  标本的获取  在末次给药24 h后，各组大鼠均给予HMG 150 U/kg腹腔注射，48 h后给予HCG 1 000 U/kg腹腔注射，14～16 h后断头处死大鼠，迅速取出卵巢，于显微镜下用TB针头划破输卵管膨大部，收集卵丘团，钢针切割分离颗粒细胞团，吸取颗粒细胞至Ependorf管中，2 000 r/min离心10 min，弃去上清，－20 ℃保存备用。透明质酸酶脱颗粒后，评估卵细胞质量［5］。优质卵细胞标准：镜下见放射冠细胞从卵子周围向四周放射性展开，颗粒细胞扩展变成半透明的不定形体，可见第一极体。其中实验组有13只、对照组有12只、假手术组有15只大鼠取到颗粒细胞。

    1.6  颗粒细胞TNF?α和IL?6表达的定量测定

    1.6.1  PCR引物  PCR引物参照文献［6，7］合成。TNF?α引物序列为上游：5'?GCC AAT GGC ATG GAT CTC AAA G?3'，下游：5'?CAG AGC AAT GAC TCC AAA GT?3'，扩增片段长357 bp；IL?6引物序列为上游：5'?CTT CCA GCC AGT TGC CTT CT?3'，下游：5'?GAG AGC ATT GGA AGT TGG GG?3'，扩增片段长496 bp；β?actin引物序列为上游：5'?AAG ATC CTG CCG AGC GTG G?3'，下游5'?CAG CAC TGT GTT GGC ATA GAG G?3'，扩增片段长327 bp。

    1.6.2  RT?PCR检测EM模型大鼠卵巢颗粒细胞TNF?α和IL?6 mRNA  参照RT?PCR检测细胞因子试剂盒（美国Promega公司）使用说明书进行操作。

    1.6.3  定量分析  将凝胶电泳图像输入美国Kodak凝胶分析系统，应用1 D Image Analysis Software进行表达强度分析，相对系数。相对系数＝细胞因子表达强度/β?actin表达强度。

    1.7  统计学方法  计量资料采用t检验，以α=0.05为检验标准，计数资料采用χ2检验，应用SAS 8.1软件包进行统计处理。

    2  结  果

    2.1  祛瘀解毒方颗粒对EM大鼠优质卵细胞数以及优质卵细胞率的影响  实验组优质卵细胞数和优质卵细胞率均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）；与假手术组相比，差异无统计学意义（P>0.05）。对照组优质卵细胞数和优质卵细胞率则低于假手术组，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。表1  优质卵细胞数目及优质卵细胞率

    2.2  祛瘀解毒方颗粒对大鼠颗粒细胞TNF?α和IL?6 mRNA表达的影响  对照组大鼠颗粒细胞TNF?α和IL?6 mRNA的表达强度及表达相对系数明显升高，与假手术组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。实验组颗粒细胞TNF?α和IL?6 mRNA表达强度及相对系数明显降低，与对照组相比，差异有统计学意义（P<0.05），与假手术组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。说明EM模型大鼠颗粒细胞TNF?α和IL?6 mRNA表达升高，经中药后实验组大鼠颗粒细胞TNF?α和IL?6 mRNA表达下降。见表2和图1。 表2  颗粒细胞TNF?α和IL?6 mRNA表达

    3  讨  论

    卵巢颗粒细胞是卵泡内主要的体细胞成分，在卵泡发育和卵母细胞成熟的过程中起重要作用，可通过自分泌或旁分泌作用，维持有利于卵母细胞成熟的微环境。颗粒细胞分泌的细胞因子（如IL?1β、IL?6和TNF?α）在EM妇女中水平较高［8］，由此推断细胞因子介导的炎性环境可能会影响卵母细胞的受精［2］。研究证实TNF?α可抑制颗粒细胞分化及芳香化酶活性，抑制黄体生成素/绒毛膜促性腺激素刺激的孕酮生成，参与卵泡闭锁及黄体细胞凋亡，给卵母细胞传递了有害的信号［9，10］。中医学典籍中无EM病名，据其临床表现当属“痛经”和“不孕”等范畴。我们在长期临床实践中出血瘀蕴毒伤络致气血阴阳失调是引起EM的基本病理基础，治疗宜从瘀毒论治［11］，祛瘀解毒方中红藤、玫瑰花、金银花、连翘、丹参等具有祛瘀解毒和通络止痛之效。

    本研究发现对照组EM大鼠优质卵细胞数目较少，优质卵细胞率较低，颗粒细胞TNF?α和IL?6 mRNA表达较高，与假手术组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。推测EM模型大鼠卵细胞质量下降可能与颗粒细胞中巨噬细胞数量增多、活性增强，TNF?α和IL?6分泌增多，导致卵子微环境改变有关。与对照组比较，实验组EM大鼠优质卵细胞数目增多，优质卵细胞率提高，颗粒细胞TNF?α和IL?6 mRNA表达下降，差异有统计学意义（P<0.05），提示祛瘀解毒中药可能通过降低卵巢颗粒细胞TNF?α和IL?6 mRNA表达，以旁/自分泌方式直接或间接参与卵巢功能的局部调节，但确切机制尚待研究。

【】
  1 Gazvani R, Templeton A. New consideration for the pathogenesis of endometriosis. Int J Gynaecol Obstet. 2002; 76(2): 117?126.

2 Pellicer A, Albert C, Garrido N, et al. The pathophysiology of endometriosis?associated infertility: follicular environment and embryo quality. J Reprod Fertil Suppl. 2000; 55: 109?119.

3 Vernon MW, Wilson EA. Studies on the surgical induction of endometriosis in the rat. Fertil?Steri. 1985; 44(5): 684?694.

4 Shi XY. Advanced medical experimental zoology. Beijing: People's Military Medical Press. 2000: 332?335. Chinese.

施新猷. 医学实验动物学. 北京: 人民军医出版社. 2000: 332?335.

5 Zhuang GL. Advanced assisted reproductive techniques. Beijing: People's Medical Publishing House. 2005: 232?233. Chinese.

庄广伦. 现代辅助生育技术. 北京: 人民卫生出版社. 2005: 232?233.

6 Lv P, Paul SC, Xiao Y, et al. Effects of thalidomide on the expression of adhesion molecules in rat liver cirrhosis. Mediators Inflamm. 2006; 2006(4): 93253.

7 Gong JP, Wu CX, Liu CA. Intestinal damage mediated by Kupffer cells in rats with endotoxemia. World J Gastroenterol. 2002; 8(5): 923?927.

8 Carlberg M, Nejaty J, Fr?ysa B, et al. Elevated expression of tumour necrosis factor alpha in cultured granulosa cells from women with endometriosis. Hum Reprod. 2000; 15(6): 1250?1255.

9 Trounson AO, Gosden RG. Biology and pathology of the oocyte. Cambridge:The Press Syndicate of the University of Cambridge. 2003: 29?40.

10 Naz RK, Zhu X, Menge AC. Expression of tumor necrosis factor?alpha and its receptors type I and type Ⅱ in human oocytes. Mol Reprod Dev. 1997; 47(2): 127?133.

11 Lian F, Wang XB, Zhang JW, et al. Thoughts and methods of traditional Chinese medicine in treating endometriosis. Zhong Yi Za Zhi. 2002; 43(7): 545?546. Chinese.

连方, 王希波, 张建伟, 等. 中医治疗子宫内膜异位症的思路与方法. 中医杂志. 2002; 43(7): 545?546.