人乳腺癌组织支原体感染的检测

                       作者：叶明 李鹏 王远明 顾宏牵

【摘要】  目的　探讨支原体感染和乳腺癌发生、预后的关系及可能的影响机制。方法　应用免疫组化方法及逆转录多聚酶链反应，对165例乳腺癌组织及癌周正常乳腺组织、80例乳腺良性病变组织支原体感染及

c-myc、H-ras基因表达进行检测。结果　乳腺癌组织、乳腺癌周正常乳腺组织、乳腺良性病变组织猪鼻支原体PD4阳性率分别是30.30%、9.70%、7.50%，前者与后两者之间比较，差异均有统计学意义（χ2分别=21.89、15.89,P均<0.05）。支原体感染阳性、阴性的乳腺癌组织c-myc 、H-ras 基因表达率分别是50.00%、27.83%，两者之间差异有统计学意义(χ2=7.57, P<0.05)；支原体感染阳性、阴性的乳腺癌患者5年生存率分别是80.01%、87.02%，两者之间比较差异无统计学意义（χ2=1.31，P>0.05）。结论　乳腺癌组织支原体感染率较高，支原体感染的乳腺癌组织c-myc、H-ras 基因表达率增高，可能和乳腺癌的发生存在一定的相关性，但和预后没有相关性。

【关键词】  乳腺癌 支原体 基因

支原体是广泛存在于界的条件致病微生物，并可与哺乳动物长期相互作用的原核生物。有学者报道，穿透支原体能使极少发生转化的小鼠胚胎细胞系C3H10T1/2恶变，且在软琼脂上形成集落，在裸鼠体内成瘤[1]，引起了许多学者的关注。细胞癌基因c-myc、H-ras在乳腺癌组织中呈高表达，可能和乳腺癌的发生、存在一定的相关性[2]。本次研究对乳腺癌组织进行支原体、c-myc、H-ras基因进行检测，探讨支原体感染和乳腺癌发生、预后的关系及可能的影响机制。

    1　资料与方法

    1.1　组织标本     取2001年1月至2007年7月三门县人民165例乳腺癌组织及石蜡标本，所有乳腺癌患者均为女性，平均年龄(48.25±12.78)岁。其中浸润性癌23例、中高分化腺癌、浸润性导管癌、浸润性小叶癌142例，根据国际抗癌协会分期法（tumor node metastasis,TNM） [3]:Ⅰ期28例，Ⅱ期85例，Ⅲ期52例。所有患者术前未行放疗或化疗，随访时间5年，随访率100%。80例女性乳腺良性病变患者作为对照组，平均年龄(50.67+9.45)岁，其中乳腺纤维瘤55例、乳腺囊性增生症25例。两者一般情况差异无统计学意义（P>0.05）。

    1.2试剂、步骤、方法    单克隆抗体PD4（由北京大学临床肿瘤医院寿成超教授馈赠），其对应抗原为猪鼻支原体的一种膜蛋白，EnVisionTM+试剂盒（购自DAKO公司）。TRizol Reagent、引物、反转录酶、多聚酶链反应扩增试剂盒（由上海生工有限公司生产）。采用EnVision二步法进行检测, 磷酸盐缓冲液代替一抗作阴性对照，用已知阳性乳腺癌组织切片作阳性对照，具体步骤按照试剂盒说明书进行操作，过程为4 um切片，脱蜡，酒精水化，3%过氧化氢10 min,微波炉内进行抗原修复，加单克隆抗体，4℃过夜，经磷酸盐缓冲液洗涤后加入二抗及相应的底物显色液，封片后进行观察。

    1.3　引物、反应条件、扩增条带 　TRizol 一步法提取总RNA,以提取液作为模板采用cDNA逆转录，后按照聚酶链反应扩增试剂盒说明指南进行操作。内参照基因GAPDH:扩增长度；672bp，上游引物：5′-TCA CCA TCT TTC AGG AGC GAG-3′，下游引物：5′-TGT CGC TGT TGA AGT CAG AG-3′,c-myc(扩增长度216bp)上游引物：5′-GAATGTCAAGAGGC-GAACACA-3′，下游引物5′-CGTCGTTTCCGCA-ACAAG-3′，PCR扩增条件：93℃温育5min; 94℃ 变性30s, 64℃复性30s, 72℃ 延伸1min,共36个循环。末次循环 72℃延伸5min。H-ras(扩增长度170bp),上游引物：5′-AGGGCCCTCCTTGGCAGG-3′，下游引物：5′-GTCGTATTCGTCCACAAAATGC-3′，95℃温育5min; 94℃ 变性30s, 58℃复性30s, 72℃ 延伸1min,共36循环。末次循环 72℃延伸5min。后取扩增产物进行电泳。表达阳性者可见目的基因和内参基因两条条带，表达阴性者仅见内参基因一条条带。3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）的扩增条带为672bp，c-myc的扩增条带为216bp, H-ras的扩增条带为170bp。

    1.4　判断标准　随机选择5个高倍视野，按照阳性细胞占肿瘤细胞百分比的平均数划分，阴性：阳性≤25%且染色浅；阳性:阳性细胞>25%且染色深。PD4表达在胞浆和胞膜。

    1.5　统计学方法　采用SPSS 10.0软件分析。计数资料采用χ2检验。设P<0.05为差异有统计学意义。

    2　结果

    2.1　乳腺癌组织、乳腺癌周正常乳腺组织、乳腺良性病变组织支原体感染情况见表1

    　　由表１可见，乳腺癌组织和癌周组织、乳腺良性病变组织支原体感染差异均有统计学意义（χ2分别=21.89，15.89，P均<0.05)；癌周正常乳腺组织和乳腺良性病变组织差异无统计学意义(χ2=0.32，P>0.05)。

    2.2　支原体感染阳性、阴性的乳腺癌组织、乳腺癌周正常乳腺组织、乳腺良性病变组织的 c-myc、H-ras 基因表达情况见表2

    　　由表2可见，PD4+乳腺癌组织c-myc、H-ras 基因表达和PD4-乳腺癌组织、癌周组织、乳腺良性病变组织比较，差异均有统计学意义（χ2分别=7.57、54.32、35.90，P均<0.05）。PD4-乳腺癌组织和乳腺癌周正常乳腺组织、乳腺良性病变组织比较，差异均有统计学意义（χ2分别=25.17、16.30，P均<0.05）。乳腺癌周正常乳腺组织和乳腺良性病变组织比较，差异无统计学意义（χ2=0.11，P>0.05）。

    2.3　对乳腺癌患者术后进行随访，支原体感染阳性的乳腺癌患者5年生存率为80.01%，支原体感染阴性的乳腺癌患者5年生存率为87.02%，支原体感染阳性、阴性的乳腺癌患者5年生存率比较差异无统计学意义（χ2=1.31，P>0.05）。

    3　讨论

    　　支原体寄居于细胞表面或细胞内部，与多种疾病有关，如肺炎、盆腔感染、泌尿生殖道感染、关节炎、不育及自发流产等，并且是爱滋病的协同致病因子。有报道，在胃肠道肿瘤、喉癌、卵巢癌、Kaposi内瘤、肺癌，均能检测到支原体抗原，且和部分肿瘤的发生、及预后有一定的相关性[4，5]。

    　　本次研究中，乳腺癌支原体感染率在30％左右，与乳腺良性病变比较，差异有统计学意义（P<0.05），表明支原体感染可能是乳腺癌发生的一个生物学因素，但同时缺乏直接的分子指标的证据，也可能是支原体嗜瘤或单纯的伴随现象。癌周正常乳腺组织、乳腺良性病变组织也可检测到支原体抗原，说明支原体感染存在的普遍性。c-myc、H-ras是细胞癌基因，它们的高表达可能是细胞恶性转化的一个可能因素。Tshi等[1]用发酵支原体及穿透支原体感染极少发生自发转化的小鼠胚胎细胞系C3H10T1/2，11周后细胞出现恶性改变， H-ras、c-myc mRNA表达显著增高，若用抗生素杀灭支原体，则H-ras、c-myc mRNA迅速下降，细胞恶性特征遂转为正常，若支原体感染持续18周，无论支原体有在与否，C3H细胞均高水平表达H-ras、c-myc，细胞株转化为癌细胞。本次研究中，乳腺癌组织c-myc,H-ras基因也呈现高表达，而乳腺癌周正常乳腺组织、乳腺良性病变组织c-myc，H-ras基因均呈低水平表达。在支原体感染阴性的115例乳腺癌中，c-myc、H-ras基因表达阳性率在27.83％，而在支原体感染阳性的50例乳腺癌组织中，c-myc、H-ras基因表达阳性率为50.00％，两者之间差异有统计学意义（P<0.05），说明支原体感染可能是乳腺癌组织c-myc、H-ras基因高表达的一个诱因,可能和乳腺癌的发生具有一定的相关性。支原体不同于病毒，不是将自身基因导入宿主基因，可能是通过慢性感染影响细胞从胞膜到胞核的信号传递，引起H-ras、c-myc基因的过度表达，导致细胞发生恶性转化[6]。

    　　对乳腺癌患者术后进行随访，支原体感染阳性、阴性的乳腺癌患者5年生存率差异没有统计学意义（P>0.05），说明支原体感染对乳腺癌患者的预后没有相关性。有学者报道支原体感染是喉癌预后的一个不良因素[4]。

    　　Ilantzis 等[7]报道，支原体感染能促进肿瘤的组织的转移，增强肿瘤细胞的侵袭力。Ushio等[8]报道人结肠癌细胞RPNH4788在感染支原体后，其转移能力增强10倍以上。本次研究后期将开展支原体感染与乳腺癌侵袭转移方面的相关性研究。尽管较多实验表明支原体感染和肿瘤发生存在一定相关性，但由于支原体难以培养、不易观察，且支原体污染广泛存在，对试验结果的客观评定较为困难，因此对这一问题的回答需要大量的试验研究及人群流行病学的研究。

【文献】
  １ Tsai S, Wear DJ, Shih JW, et al. Persist infection and multi- stage malignant transformation[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92(22):10197-10201.

2 汤钊猷. 肿瘤学[M]. 第2版. 上海：复旦大学出版社，2003. 76-89.

3 吴在德. 外[M]. 第5版. 北京：人卫出版社，1998.359.

4 舒薇, 孙宝春, 郎军添, 等. 人喉癌组织中支原体感染的检测[J]. 第二军医大学学报, 2006, 27（8）：817-819.

5 Huang S, Li Y, Shou CC, et al. Mycoplasma infections and different human carcinomas[J]. World J Gastroentero, 2001,7(2):266-269.

6 刘斌波, 刘先洲, 刘东瀛, 等. 猪鼻支原体抗原在人结肠腺癌细胞表达的研究[J]. 武汉大学学报, 2001, 22（1）:6-7.

7 Ilantzis C, Thomson DMP, Michaelidou A, et al.Identification of a human cancer related organ-specific neoantigen[J].Mic-robiol Immunol ,1993,37(2)：119-128.

8 Ushio S, Iwaki K, Taniai M, et al. Metastasis-promoting activity of a novel molecule ,Ag243-5,derived from myco-plasma, and the complete nucleotide sequence[J]. Microbiol Immunol, 1995, 39(2):393-400.