麦冬水溶性多糖OPB的分离纯化及抗氧化活性研究

【摘要】  目的：从麦冬中提取出水溶性粗多糖OP，经分离纯化，得到均一多糖OPB，并研究其组成、性质以及抗氧化能力。方法：粗多糖经DEAE Sepharose CL?6B柱层析分离纯化得到OPB，经 HPLC和醋酸纤维素薄膜电泳法检验其均一性，超氧阴离子清除实验和羟自由基清除实验鉴定其抗氧化能力。结果：OPB是均一组分多糖，GC分析表明它的单糖组成是葡萄糖。结论：OPB有较强的超氧阴离子清除作用。

【关键词】  麦冬；水溶性多糖；分离纯化；抗氧化活性

基金项目:国务院侨办科研基金资助项目(07QZR07);福建省基金计划资助项目(Z0516009)
　　

　　麦冬为百合科沿阶草属植物的干燥块根，是常用的滋阴中药，始载于《神农本草经》，有滋阴生津，润肺清心的功能［1］。为了合理利用麦冬资源并寻找新的麦冬有效成份，本文对麦冬粗多糖进行分离纯化，并对其抗氧化活性进行了研究。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料、试剂与仪器  材料：麦冬，购于福建泉州百合药店。试剂与仪器：氯化硝基氮蓝四唑(NBT)，吩嗪硫酸甲酯(PMS)，脱氧核糖，硫代巴比妥酸(TBA)及还原型辅酶I(NADH·2Na)，标准品为Sigma公司试剂；DEAE-sepharose CL?6B为Pharmacia公司产品；其他试剂均为上海化学试剂有限公司分析纯。MC99?2自动核酸蛋白分离层析仪，上海沪西分析仪器厂；高效液相色谱，安捷伦HP1100；气相色谱仪，安捷伦6890N。

　　1.2  实验方法

　　1.2.1  麦冬粗多糖的提取  准确称取麦冬200 g，加入2000 mL 80%乙醇，在50℃水浴中回流提取6 h，过滤，将残渣烘干后取100 g加入4000 mL蒸馏水，90℃恒温水浴下提取2 h，过滤，滤液在60℃减压旋转蒸发浓缩至小体积，离心10 min(3500 r/min)，弃去沉淀物，上清液加入4倍体积无水乙醇，4℃过夜。次日离心，取沉淀，沉淀常规干燥得粗多糖。

　　1.2.2  粗多糖的DEAE?Sepharose CL?6B柱层析制备  500 mg麦冬粗多糖溶于10 mL蒸馏水，上样，先后用蒸馏水和0?1M NaCl进行洗脱，流速40 mL/h,1管/12 min，自动部分收集器收集。用苯酚?硫酸法测定糖的分布情况，制定洗脱分布图，按各波峰范围部分收集洗脱液。由分离层析仪中的UV?160A紫外光谱于280 nm下同步检测蛋白质，记录仪记录。

　　1.2.3  多糖样品纯度鉴定方法  采用HPLC和醋酸纤维素薄膜电泳法，色谱柱为SUGAR KS?804，水作流动相，流速1 mL/min，柱温50℃，示差检测器检测。

　　1.2.4  性质分析［2-3］  红外光谱分析确定是否含有多糖特征吸收峰；采用气相色谱法(GC)分析糖组成；糖含量测定采用苯酚?硫酸法；蛋白质含量测定采用考马斯亮蓝法。

　　1.2.5  体外抗氧化实验［4-5］  超氧阴离子清除能力实验用样品浓度为0(对照)，25，50，70，100和120 mg/mL；羟自由基清除作用样品浓度为0(对照)，1.56，3.125，6.25，12.5，25和50 mg/mL。

　　2  结果与分析

　　2.1  粗多糖的提取与分离纯化  麦冬经水提取，粗多糖得率为28.5%，命名为OP。OP的蒸馏水洗脱液经苯酚?硫酸检测只含有一个糖洗脱峰，但含量较少，暂且不做分析。　　OP经DEAE-Sepharose CL?6B NaCl梯度洗脱曲线如图1所示。由图1可以看出，OP经0-1M NaCl梯度洗脱，洗脱液经苯酚?硫酸检测只含有一个糖洗脱峰，紫外检测仪在280nm下也检测到一个蛋白质洗脱峰，并且与糖洗脱曲线相吻合，可能是结合蛋白，收集25-55管洗脱液，透析，浓缩，醇沉，沉淀常规干燥命名为OPB。

　　2.2  OPB的纯度鉴定  配制0.1%的样品液，0.4 μm纤维素膜过滤，进样量20 μL。OPB的高效液相色谱结果(图2)检测出单一对称峰，证明OPB是纯度较好的样品。OPB的醋酸纤维素薄膜电泳结果只显示一条区带，再次验证OPB为纯度较好的样品。

　　2.3  OPB的性质分析  经苯酚?硫酸法和考马斯亮蓝法检测得出OPB糖含量95.8%，蛋白质含量4%。

　　2.3.1  OPB的单糖组成分析  OPB经酸水解，衍生化后的气相色谱结果如图3所示。由于在衍生物的制备过程中会产生衍生物的异构体，使得色谱分析时每种单糖会产生几个峰，对照标准单糖的气相色谱图，2 min前是溶剂峰，5.098 min和5.868 min出现的峰代表葡萄糖，5.475 min出现的峰是内标甘露醇，所以得出OPB由葡萄糖组成。

　　图1  OP的DEAE Sepharose CL?6B NaCl洗脱曲线（略）  

　　图2  OPB的HPLC图谱（略）                

　　图3  OPB的GC图谱（略）

　　2.3.2  OPB的红外光谱分析  红外光谱分析表明，OPB在3600-3200 cm 有-OH吸收峰，在2923 cm左右有一吸收峰，为-CH、-CH2的共振吸收峰，在1635 cm左右有多糖的水合振动峰，证明OPB的主要成分是多糖。

　　2.3.3  OPB的分子量分析  多糖样品的分子量测定采用高效液相色谱法，高效液相色谱柱为SUGAR KS?804，水作流动相，流速1 mL/min，柱温50℃，示差检测器检测。先测出各标准品T2000，T500，T10，T70，T40及葡萄糖的保留时间，按公式Kav=(Ve-Vo)/(Vt-Vo)求出对应的Kav，以LogMw(分子量的对数)对Kav作图得标准曲线，如图4。同样测出样品的保留时间，求出其Kav，从标准曲线上即可求出其分子量，根据OPB的保留时间得出OPB的分子量是4万左右。

　　2.4  OPB体外抗氧化作用  　　如图5所示，OPB对超氧阴离子的清除作用随反应体系中添加量的增加而逐渐升高，呈现量效关系。OPB在反应体系含量达12 mg时，对超氧阴离子的清除率达到93.95%;从图6可以看出，OPB有一定的清除羟自由基作用，当样品含量大于0.156 mg时，OPB即显示抑制羟自由基的能力，随着反应体系中OPB含量的升高，抑制作用也逐渐加强，但增加的较缓慢。

　　图4  log Mw?Kav校正曲线（略）

　　图5  超氧阴离子清除作用（略）

　　图6  羟自由基清除作用（略）

　　3  结论
     　　
　　为除去麦冬中皂甙、单糖、双糖、低聚糖、苷类、生物碱、茶多酚、氨基酸、醇溶性蛋白质物质，我们用80%乙醇回流对麦冬进行预处理。得到的残渣烘干后用于水煮提取，得麦冬粗多糖。粗多糖经DEAE Sepharose CL?6B 柱层析分离纯化，在NaCl梯度洗脱后得到一个组分OPB，杂蛋白全部在70管后才被洗脱出来，所以粗多糖经DEAE Sepharose CL?6B 柱层析后得到很好的分离纯化。通过高效液相色谱和醋酸纤维素薄膜电泳鉴定，OPB是纯度较好的样品，经红外光谱鉴定OPB有多糖的特征吸收峰，气相色谱研究表明，OPB由葡萄糖构成。OPB显示较强的超氧阴离子的清除作用，在反应体系含样品量达12 mg时，对超氧阴离子的清除率达到93.95%。

【】
  　　［1］吕丽娟,马明辉,贡济宇,等.正交实验法优选麦冬多糖提取工艺［J］.长春中医药大学学报,2007,23(2):30-31.

　　［2］陈凤清,陈智博,温得中,等.长白山松杉树芝子实体水溶性粗多糖的纯化及结构初探［J］.吉林中医药,2005,25(12):53-54.

　　［3］邢文善,纪耀华,张彦形,等.半枝莲粗多糖的提取及总糖的含量测定［J］.吉林中医药,2005,25(7):56.

　　［4］Zhaojing Wang,dianhui Luo.Antioxidant activities of different fractions of polysaccharide purified from Gynostemma pentaphyllum Makino［J］.Carbohydrate Polymers,2007,68:54-58.

　　［5］王昭晶,罗巅辉.穿山龙多糖的提取,纯化与抗氧化活性研究［J］.天然产物研究与开发,2007,19(1):29-34