牛膝药理血清对血管内皮细胞影响的实验研究

                       作者：韦倩，盖国忠，伊鹏菲，王帅玉

【摘要】  目的:研究牛膝药理血清对血管内皮细胞(VEC)增殖的影响和对脂多糖(LPS)所致血管内皮损伤的预防和修复作用。方法:给Wistar大鼠灌服牛膝醇提物后取其血清加至单层培养的VEC细胞中观察VEC的形态及功能变化。结果：牛膝药理血清能够促进血管内皮细胞的增殖，能够对细胞起到保护作用，有效预防脂多糖对其的损伤。结论：本课题为牛膝对高血压病预防作用的深入研究奠定了基础。

【关键词】  高血压病；血清学；药；牛膝；大鼠

基金项目:吉林省科技厅、吉林省杰出青年研究计划项目(编号5-28-219)
　　

　　近年来研究表明［1］,牛膝有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、镇痛抗炎、子宫兴奋及抗生育和抗凝血的作用。在已证明牛膝煎液有降低原发性高血压大鼠血压作用的基础上，为进一步研究牛膝的降压机理，笔者给大鼠灌服牛膝提取液一定时间后，收集其血清进行实验，观察单味中药牛膝在体外对血管内皮细胞的影响，报告如下。

　　1  材料

　　1.1  实验动物  Wistar大鼠,均为雄性,体重220-280 g,由吉林大学实验动物中心提供。

　　1.2  实验药物  牛膝醇提物，由长春中医药大学新药药理实验室制作，每毫升含生药4.8 g。牛膝购自北京同仁堂药材有限公司，由长春中医药大学邓明鲁教授鉴定。

　　1.3  主要试剂  1640培养液(GIBCO公司)、胎牛血清(杭州四季青公司)；Ⅰ型胶原酶(Sigma公司)；兔抗鼠Ⅷ因子、免疫组化染色试剂盒、DAB染色试剂盒(北京博奥森生物技术有限公司)；LPS(Si gma公司)；MTT(Genview公司)。

　　2  方法

　　2.1  内皮细胞的培养与鉴定［2-3］  以组织贴壁法分离内皮细胞，实验用第3-5代(培养基为1640，含10%胎牛血清)。用第Ⅷ因子相关抗原检测鉴定。

　　2.2  含药血清的制备选择  Wistar大鼠7只，6只分别每日给予牛膝提取液3  mL(参照标准为10 mL/kg)灌胃，另1只每日给予3 mL生理盐水作为对照。7 d后，于最后1次灌药后1 h(灌药前禁食不禁水12 h)经腹主动脉采血，无菌分离血清，经液氮冷冻后，-20℃保存备用。

　　2.3  MTT法观察不同浓度的牛膝药理血清对细胞增殖的影响  取对数生长期的内皮细胞进行细胞计数，接种于96孔培养板中，使每孔细胞数为5×103个,分为空白组、胎牛血清组(对照组)和牛膝血清组，空白组加入1640培养液(1孔)，胎牛血清组(2孔)加入含10%胎牛血清培养液，牛膝血清组(4-9孔)加入总血清浓度为10%的混合血清，其中牛膝药理血清浓度分别为1.25%、2.5%、3.75%、5%、7.5%、10%，余为胎牛血清，第10、11孔为15%、20%的牛膝药理血清。每组4个平行孔，每孔总反应体系200 μL，在37℃，5%CO2饱和湿度条件下培养24h后每孔加入5 mg/mL MTT 20 μL，继续培养4 h，弃液，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)100 μL，震荡10 min使混匀，选择490 nm波长，于自动酶标仪上测定各标本吸光度A(OD)值，取各组均数进行统计。

　　2.4  MTT法观察牛膝血清对体外培养的血管内皮细胞脂多糖(LPS)导致的损伤的防护和修护作用  取对数生长期的VEC进行计数，接种于96孔培养板中，使每孔细胞数为5×103个,将VEC分为正常对照组、损伤组、保护组、修护组，每组设4个样本，每孔总反应体系200 μL，加入10％胎牛血清后放入37 ℃，5% CO2培养箱培养24 h后弃液，并用PBS轻轻洗3次，保证板上没有血清残留。正常对照组加入2%胎牛血清；保护组分别加入0.5％、1％、1.5％、2％的含药血清，用胎牛血清补足至血清浓度为2%，置入培养箱24h后弃液并加入LPS，使其终浓度为25 mg/mL，继续培养48 h；修护组先加入LPS，使其终浓度为25 mg/mL，置入培养箱中作用48h后加入牛膝中药血清0.5％、1％、1.5％、2％，并用胎牛血清补足至血清浓度为2%，继续培养24 h；最后将所有孔内液体弃之，加入DMSO(二甲基亚砜)100 μL，震荡10 min使混匀，选择490 nm波长，于自动酶标仪上测定各标本吸光度A(OD)值，取各组均数进行统计。

　　2.5  数据统计  用SPSS统计软件进行处理，数据以(±s)表示。

　　3  结果

　　3.1  大鼠胸主动脉内皮细胞的培养与鉴定

　　3.1.1  到置相差显微镜观察  将大鼠胸主动脉切开后紧贴六孔板底，经过3-4 d的贴壁培养后将内皮弃之，细胞生长成为多数单层小多角形集落，培养7-14 d后，细胞生长迅速，逐渐融合形成排列紧密的单层细胞。细胞呈铺路石样镶嵌排列，无重叠生长现象，细胞为多角形，细胞核为圆形或椭圆形，可见核仁1-2个，随传代次数增多，细胞分裂旺盛，可见多个双核细胞。

　　3.1.2  第Ⅷ因子相关抗原检测  取已平铺成单层的2-3代血管内皮细胞，应用免疫组化染色试剂盒染色，镜下见胞浆中呈现棕黄色颗粒，表明第Ⅷ因子相关抗原存在。

　　3.2  VEC生长与功能变化

　　3.2.1  对细胞增值的影响  见图1(横轴为分组，纵轴为OD值)。

　　图1  MTT法观察不同浓度的含药血清对细胞增殖的影响（略）
  　　
　　3.2.2  对细胞损伤的预防和保护作用  见表1。   

　　表1  MTT法观察含药血清对血管内皮细胞损伤的防护和修护作用（略）

　　注：与损伤组比较△P＜0.05

　　4  讨论
     　　
　　MTT法是检测活细胞中线粒体脱氢酶的一种简便、高灵敏度的方法，可反映细胞活力的高低，从而间接地反应了细胞的增殖情况。实验1表明，随着中药血清比例的增加，内皮细胞的数量也成上升趋势，说明牛膝药物血清对正常血管内皮细胞的增殖有促进作用。实验2的结果表明：防护组细胞的数量随着药理血清比重的增加而增加，均显著区别于损伤组，说明牛膝中药血清对血管内皮细胞有较好的保护作用。而修护组的细胞数量却随着中药血清比重的增加而减少，这与预期的实验结果有所差异，我们在实际中培养液的血清浓度采用的是两种量，维持浓度(2%)和生长浓度(10%)，MTT结果一致，都呈递减趋势。这并不能说明牛膝中药血清对内皮细胞没有保护作用，分析此种现象出现的理由可能有3种，一是损伤后细胞数量过少，降到了对数生长期以下；二是相对于损伤后的细胞数量，中药血清的浓度偏大，对细胞产生毒性作用；三是中药血清修复时间不够。建议在今后的实验中将传入96孔板的细胞浓度增大，使损伤最大组细胞数量维持在每孔1×104个左右再进行实验研究，并延长中药血清的作用时间。
     　　
　　本组实验说明了牛膝药理血清能够促进血管内皮细胞的增殖，能够对细胞起到保护作用，有效预防脂多糖对其的损伤。为今后牛膝对高血压病预防作用的深入研究奠定了基础。

【】
  　　［1］赵兴梅,徐光忠.川牛膝和怀牛膝的药理研究概况［J］.华西药学杂志,2004,19(3):205-207.

　　［2］张进华,丁彦青,周 军.人主动脉内皮细胞培养方法［J］.细胞与分子免疫学杂志,1997,13(1):55-56.

　　［3］接传红,高健生.中药血清对体外培养脐静脉内皮细胞增殖的影响［J］.中医眼科杂志,2004,14(4):214-216.