离体供心保存技术的研究现状

                         作者：张剑锋，崔勇丽，黑飞龙

【关键词】  心脏保存液；内皮细胞；内皮源性舒张调节因子；内皮源性超极化因子

  1  心脏保存液概述

    心脏保存液是心脏移植中用于供心缺血期间心脏保护的液体。现有的心脏保存液多数是以心肌细胞保护为中心环节而设计的器官保存液，已取得较好的临床效果。

    目前就心脏保存液对心肌细胞的保护机制已较为明确，但是对冠脉血管的保护作用尚不十分清楚。现已明确，冠脉内皮细胞的完整对术后心功能恢复起关键作用。新近研究显示心脏移植远期首位的致死原因为心脏移植物的血管病变（Cardiac allograft vasculopathy,CAV）［1］。防止保存液低温副作用和保护冠脉内皮细胞结构和功能的完整是心脏保存液研究的两个重要环节。目前国内较为普遍应用的HTK液（Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate）及ＵＷ液（University of Wisconsin solution），属细胞内液型保存液。Celsior溶液，属细胞外液型保存液。目前对各种心脏保存液保存效果的研究结果并不一致。Kajihara［2］研究认为：UW液比Celsior更利于长时间器官保存及保存24h后冠状动脉内皮功能的恢复。但有研究认为在心脏移植中使用Celsior保存液比其他晶体及含血保存液更能保护G-蛋白介导的冠状动脉舒张功能［3］。王彦伟等［4］研究认为UW液对于大鼠胸主动脉内皮源性超极化因子(EDHF)介导血管舒张功能有抑制作用。保持冠状动脉形态和功能的完整是决定心肌灌注效果的关键因素。冠脉血管的损伤会改变冠脉的张力，影响冠脉血流。在心脏保存时，冠脉血管内皮浸没在保存液中会受到影响，低温减少了细胞ATP生成，损害了细胞的修复过程，导致内皮细胞水肿，空泡变性、染色质边集、核膜皱缩进而DNA降解，甚至内皮细胞之间的分离、凋亡和缺失。高钾会导致冠脉内皮细胞的复制能力下降进而引起冠状动脉舒张能力的下降。这些损伤会导致冠脉出现“无复流现象”。

    2  供心低温期间冠脉血管损伤机制

    2.1  心脏保存液对冠脉血管内皮细胞的影响及其机制  在心脏保存期间溶液中的高钾成分、低温、机械损伤（灌注压及时间）及缺血再灌注损伤均不同程度的对冠脉内皮造成损伤。内皮细胞的应激反应是缺血再灌注损伤的主要原因。内皮细胞发生应激反应时，其内一系列炎性因子、促凝血因子、血管活性因子、蛋白产物会导致血管内微栓的形成，减少冠脉血流，激活炎性细胞。这些蛋白产物包括E-选择蛋白，P-选择蛋白，血管粘附因子（ICAMs），会导致心脏停跳后白细胞吸附在血管内皮，引发缺血再灌注损伤。Valen等［5］研究认为内皮细胞损伤的机制与核因子－кB（NF-кB）有关，氧化应激反应激活IκBα的酪氨酸的磷酸化, IκBα在细胞质内做为NF-кB的抑制剂与NF-кB耦联，磷酸化后与NF-кB分离，NF-кB进入细胞核内可以使作用的靶基因转录。因此通过NF-кB的转染抑制内皮细胞激活的信号途径，减少体内NF-кB含量将改善心脏停跳后再灌注导致的内皮损伤。

    2.2  心脏保存液对内皮源性舒张调节因子（EDRF）的影响  内皮具有多种功能包括血管张力的调节，防止血小板的聚集和增殖及内皮粘附分子的表达等,血管内皮源性的舒张受不同的血管内皮舒张调节因子的调节，包括：前列环素（PGI2），一氧化氮（NO），EDHF。

    2.2.1  前列环素  前列环素是第一个被定义的内皮源性舒张因子。磷脂酶A2使膜磷脂 转变为花生四烯酸，然后通过环加氧酶（COX）转变为PGI2和其他几种前列腺素（PGE2，PGF2α,PGD2），血栓素A2（TXA2）。前列环素可以导致大部分动脉包括冠状动脉血管床的舒张，受CAMP的调节，促使细胞内Ca2+外流,减少收缩组织对Ca2+的敏感性。当内皮细胞受到剪切力、缺氧时，其在感受器调节机制下会比平滑肌细胞多释放出10～20倍的PGI2，但在心脏保存期间，COX的产量显著降低，导致PGI2的产量减少，影响冠脉的舒张［6］。

    2.2.2  NO  NO是L-精氨酸通过一氧化氮合酶（NOS）产生。至少有两种形式的NOS，主要的一种存在于神经元细胞和脉管系统，可以被细胞内增加的Ca2+激活。Sathishkumar等［7］发现ＮＯ通过激活Na+-K+ATP酶活性，减少电压力敏感的Ca2+通道的Ca2+内流，使冠脉血管平滑肌超极化，促进冠脉血管的舒张功能。研究表明心脏在保存期间，NO依赖的内皮功能会受到损伤。Gohra［8］研究检测NO－亚硝酸盐的末期产物，发现在心脏晶体液停跳后70min NO的释放显著降低，再灌注后还在继续降低，在4℃冷晶体液保存过程中加入L-精氨酸和生成NO的底物可以减少NO的丢失。同样，在用UW液灌注后血管内皮细胞释放NO的能力随着血管舒张性的降低而降低，NO产物伴随着缺血再灌注期NOS的减少而减少［9］。Emerson等［10］在大鼠的腹主动脉模型中发现，使用含氧、乙酰胆碱和P-物质晶体停搏液进行血管保护，当缺血再灌注损伤的影响被排除时，NO-依赖内皮功能将被很好的保存，而且内皮反应和EDHF的易感性没有改变。很多研究表明缺血再灌注损伤是NO-依赖的内皮功能失常的主要原因。

    2.2.3  EDHF  EDHF通过开启Ca2+-敏感性K+通道（KCa通道），关闭电压力敏感性K+通道（Kv通道），存在于血管平滑肌膜的L型Ca2+通道活性被抑制，向细胞内流人的Ca2+减少，从而激活血管平滑肌的超极化舒张。很多化学物质被认为具有EDHF的作用，例如环氧二十炭烯酸EET［11］，anandamide、K+、H2O2 ［12］, 瓜氨酸，NH3，ATP等。有研究表明高钾成分如St.Thomas液和UW液都能损害人或猪的EDHF介导的冠脉功能［13］。

    3  心脏保存液中的各种成分对血管的影响

    3.1  钾  K+是器官保存液的主要成分，其浓度在各器官保存液中不同，UW液中高达125 mmol/L，St.Thomas中含20 mmol/L,HTK中含有10 mmol/L。He［14］研究证实K+浓度在30 mmol/L而非20mmol/L时会抑制内皮细胞和5-羟色胺介导的血管舒张功能，但在50 mmol/L时对于乙酰胆碱和P物质介导的冠脉舒张功能并没有显著影响，并且目前没有直接证据显示高钾减少NO的产量。He［15］在人的冠脉模型中当PGI2和NO被消炎痛和L-NNA抑制后，当保存液中K+浓度在20～125 mmol/L时，EDHF介导的内皮源性舒张和超极化作用被损害。在高钾溶液中,EDHF调节的舒张和去极化的机制为：① 高钾使冠状动脉平滑肌膜去极化并延长去极化的时间，增加超极化的困难。② EDHF通过开启K+通道使血管平滑肌细胞超极化，高钾可以抑制K+通道的这种功能。

    3.2  镁  在心脏保存液中加入镁可以加速心脏停跳，对抗高钙对心肌纤维细胞膜的不利作用，防止钙流入，维持膜的稳定性。Mg2+通过内皮依赖和非依赖机制而产生有利的血管舒张作用。Haenni［16］在人的前臂血管实验中Mg2+的灌注能促进乙酰胆碱介导的血管舒张，显示了Mg2+对内皮细胞的重要性。用NO抑制剂L-NNA进行预处理可以减少Mg2+调节的血管舒张作用。硝普纳或cGMP类似物、一磷酸鸟苷钠可以恢复血管对Mg2+的反应，证明NO-cGMP是促进Mg2+血管保护活性的途径［17］。COX系统支持PGI2、Mg2+介导的舒张作用。Pearson［18］发现低镁可以抑制乙酰胆碱和ADP对血管舒张的作用，并且抑制了NO的释放。高钾导致的EDHF功能的受损，而Mg2+则能保护EDHF-调节的舒张功能及促进超极化功能恢复。

    3.3  普鲁卡因  于心脏停搏液中加入与Mg2+相似的局麻药可以促进心脏停跳及维持心肌细胞膜的稳定性。普鲁卡因是一种血管舒张剂，在1 mmol/L的浓度时普鲁卡因通过内皮非依赖和依赖两种方式舒张血管，后者是通过NO途径。普鲁卡因虽然通过减少K+的传导使血管平滑肌细胞膜去极化，但并不影响冠脉EDHF的功能［19］。

    3.4  其他物质  保存液中还常添加非渗透性物质，如甘露醇、棉子糖、乳酸醛酸；能量代谢底物如谷氨酸盐、天冬氨酸盐、延胡索酸盐等；缓冲系统、抗氧化剂在临床上取得比较好的心肌保护的效果。但是目前对这些添加的物质对内皮的影响的机制尚不明了。

    4  新型添加物质的研究进展

    目前在心脏停跳后8 h的冠状动脉保护是心脏保存液的目标，含有各种添加成分的保存液与传统保存液相比更能促进冠状动脉功能的恢复。

    4.1  EDRF的前体或类似物  在器官保存液中加入NO前体、L-精氨酸或硝酸甘油可以保护缺血后的血管张力和内皮功能。加入前列环素类似物，如：伊洛前列素，OP-41483可以较好的保存缺血后的心功能。Yang等［20］在心脏保存液加入EDHF类似物。环氧二十炭二烯酸（EET）［11-12］，可以部分的恢复缓激肽和EDHF调节的猪的内皮血管的功能，把EET加入中度低温的ST.thomas液中证明也可以改善血管的功能［21］。

    4.2  钾通道开放剂（KCOs），Na+通道阻滞剂  Tang等［22］研究表明：阿里卡林（aprikalim）是一种ATP敏感的钾通道开放剂，可以减少因为高钾导致的Na+-Ca2+交换的增加，可以削弱Ca2+的内流，使冠脉血管平滑肌细胞膜超极化，促进心脏停跳后的血管舒张功能。其他的KCOs如KRN4884,二氮嗪（DE）经证实对EDHF调节的冠脉舒张功能具有保护作用。Na+通道阻滞剂包括河豚毒素（TTX），Na+-H+交换（NHE）抑制剂。在停搏液中加入NHE-1型抑制剂卡立泊来德（Cariporide）可以减少细胞内Na+的堆积、Ca2+超载,减少缺血后的心梗面积、组织水肿。Muraki等［23］研究离体的猪的左冠脉前降支动脉环的舒张功能变化，结果cariporide处理组舒张功能明显高于对照组，证实了它对冠脉内皮的保护的作用。

    4.3  其他物质及技术    Schroder等［24］报道在器官保存液中加入氧自由基清除物deferoxamine可以减少心肌的缺血再灌注损伤，保护内皮依赖的冠脉微血管的舒张功能。心脏保存液中腺苷对微循环损伤的保护作用尚有争议。Besirli［25］等研究发现在St.Thomas液中加入磷酸二酯酶III－抑制剂（E-1020）可以促进心功能的恢复。17β-雌二醇可以防止细胞内的钙超载，防止在高钾保存液中血管平滑肌细胞的过度收缩，保护血管内皮功能，原理是通过刺激NO的产生，而非刺激EDHF的增加。Fischer等［26］在心脏保存期间使用冠脉氧气灌注（COP）技术发现冠脉内皮细胞介导的舒张功能没有明显的改善，但也没有损害。

    5  展望

    随着心脏移植的技术成熟，对供体心脏保存的安全时限和保存质量要求越来越高，同时重视供心心肌和血管的保护将明显改善心脏移植术后心功能，减少移植物血管病变的发生率，对有效提高患者远期存活率及生活质量有重要的意义。

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