补骨脂素加长波紫外线诱导HL-60、NB4细胞凋亡时对线粒体膜电位的影响

              作者：陈楠楠，张晨，王伟，张德杰，向阳，黄世林

【摘要】  目的 研究补骨脂素（PSO）加长波紫外线（UVA）光化学疗法（PUVA）诱导人白血病细胞HL-60、NB4凋亡时对线粒体膜电位（ΔΨm）的影响。方法 细胞与不同浓度PSO，接受或不接受UVA照射后共同培养，电镜下观察细胞超微结构改变，流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡率和线粒体膜电位变化，采用多因素方差分析法进行统计学处理。结果 PUVA处理后的HL-60、NB4细胞超微结构出现明显的凋亡形态学改变； PSO、UVA照射及PUVA均可使细胞凋亡率增加，ΔΨm下降，PUVA的作用显著强于前两者（P<0.01）。结论 PUVA可诱导人白血病细胞发生凋亡，诱导凋亡的途径之一为下调线粒体膜电位水平。

【关键词】  光化学疗法；白血病； HL-60细胞；NB4细胞；凋亡；线粒体膜电位

    Abstract： Objective  To study the effects of psoralen (PSO) plus ultraviolet A (PUVA) on mitochondrial membrane potential in HL-60 and NB4 cells.Methods  Cells were incubated with PSO in different concentrations irradiated with or without UVA. The changes in cellular ultrastructure were observed under electron microscope. The apoptosis ratios and the changes of mitochondrial membrane potential were detected through flow cytometry. The factorial design and analysis of variance were used to analyze the interaction among the factors.Results  There were obvious ultrastructure changes in apoptosis in HL-60 and NB4 cells after treatment with PUVA. PSO, UVA and PUVA all increased the apoptosis ratios and decreased the mitochondrial membrane potential, and the effects of PUVA were stronger than any of the others (P<0.01).Conclusion  PUVA can induce the apoptosis of HL-60 and NB4 cells and one of the pathways to induce apoptosis is to downregulate the mitochondrial membrane potential.

    Key  words： PUVA; leukemia; HL-60 cell; NB4 cell; apoptosis; mitochondrial membrane potential

    补骨脂素(psoralen，PSO)是中药补骨脂种子中的主要成分，又称呋喃香豆素，具有光敏性质与抗肿瘤活性。PUVA是补骨脂素加长波紫外线光化学疗法，研究表明PUVA对人白血病细胞HL-60、K562、NB4均有一定的杀伤作用［1］，但其作用机制尚不清楚，本试验拟探讨PUVA对人白血病细胞HL-60、NB4细胞凋亡的作用及部分作用机制，为PUVA的临床应用提供理论依据。

    1  材料与方法

    1.1  细胞株  人急性髓细胞白血病（FAB-M2）HL-60细胞由大连医科大学惠赠；人急性髓细胞白血病（FAB-M3）NB4细胞由上海血液学研究所陈竺院士惠赠。

    1.2  药品及主要试剂  补骨脂素由大连理工大学及我院共同从纯中药补骨脂中提取和制备。二甲基亚砜（DMSO）购自北京化工厂。RPMI1640培养液、胎牛血清为Gibco产品。小牛血清系杭州四季青生物材料工程公司产品。JC-1为Molecular Probe公司产品。

    1.3  仪器和设备  流式细胞仪购自美国贝克曼库尔特公司，GLY-10型光量子血液平衡仪由徐州华卫医疗设备公司研制。

    1.4  细胞培养  HL-60、NB4细胞分别常规培养于含10%小牛血清及10%胎牛血清的RPMI1640培养基（含硫酸庆大霉素0.025 U/ml）中，于37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱中进行连续培养。

    1.5  透射电镜下观察细胞超微结构特点  收集浓度为5.0×105/ml，经PUVA处理的HL-60、NB4细胞10 ml，用PBS清洗2次，转入2.0 ml 离心管，离心（2 000 r/min）3 min，弃上清，缓缓加入2.5%戊二醛2 ml，4 ℃ 冰箱静置2 h 以上。磷酸缓冲液冲洗，锇酸固定，水洗、脱水，浸透、包埋，制定超薄切片，透射电镜下观察。

    1.6  流式细胞术测定PUVA 24 h 后细胞的凋亡情况  取浓度为4.0×105/ml，处于对数生长期的HL-60、NB4细胞株5 ml，分别加入补骨脂素0，5，10，20，40 μl，使其在反应体系中的终浓度分别为0，10，20，40，80 mg/L，放入石英比色皿中，在GLY-10型光量子血液平衡治疗仪（λ=360 nm）上以1J/m2辐射量边照射边震荡，照射时间分别为0 min，5 min。处理后各实验组细胞继续培养24 h 后，收集5.0×105细胞，用PBS洗2次，弃上清，加入100  μl 碘化丙啶（PI）染液，避光反应30 min，加入PBS 400 μl，上机检测，并用Multicycle软件分析得出相应的细胞凋亡百分率。

    1.7  流式细胞术测定PUVA 24 h 后细胞线粒体膜电位的变化情况  试验分组及处理方法同前。 收集1×106个细胞， 重悬于1 ml PBS中， 加入200 μmol  JC-1 10 μl， 37 ℃、 5%CO2孵育15~30 min， 2 ml PBS洗1次， 室温下离心（1 000 r/min）3 min，弃上清，加500 μl PBS，轻摇试管使细胞重悬，上机检测，用50 mmol CCCP 1 μl，37 ℃ 孵育5 min，进行荧光标准补偿。

    1.8  统计学方法  所有实验结果均来自至少3组平行或3次重复实验。各种计量资料以平均值±标准差（x±s）表示，采用多因素方差分析；所有统计均用SPSS11.5 统计软件进行，P＜0.05认为差异有统计学意义。

    2  结 果

    2.1  透射电镜下观察PUVA后细胞超微结构改变  HL-60、NB4细胞均出现细胞体积缩小，胞浆浓缩，胞核体积减小，可裂解成一个或数个致密体，可见核小体碎裂，核染色质聚集或边集，部分染色质致密成斑块状或沿核膜收缩成新月体状，整个细胞可裂解成大小不一的凋亡小体。

    2.2  PUVA诱导细胞凋亡的作用  应用流式细胞仪检测PUVA后24 h HL-60、NB4细胞凋亡率，见表1、2。表1  PUVA 后24 h HL-60细胞凋亡率表2  PUVA 后24 h NB4细胞凋亡率与0 min 0 mg/L比较，①P<0.01;与0 min 同浓度比较，②P<0.01

    2.3  PUVA对HL-60、NB4细胞线粒体膜电位的影响  应用流式细胞仪检测PUVA后24 h 细胞线粒体膜电位相对荧光强度的变化，见表3、4。表3  PUVA后24 h HL-60细胞线粒体膜电位的变化表4  PUVA后24 h NB4细胞线粒体膜电位的变化与0 min 0 mg/L比较，①P<0.01;与0 min 同浓度比较，②P<0.01

    3  讨论

    PSO具有抗肿瘤、抗白血病的作用，同时又具有光敏活性［2~5］，波长范围在320~360 nm 之间的紫外光照射，可激发PSO的动力效应，从而增强其抗肿瘤及抗白血病的作用。电镜和流式细胞仪检测结果显示，PUVA可诱导HL-60、NB4白血病细胞发生凋亡。与对照组（0 min 0 mg/L）相比，单纯PSO和UVA，以及PUVA均可增加细胞凋亡率，但多因素方差分析结果显示PUVA的作用要显著强于前两者，也再一次证明了PSO的光敏效应。

    线粒体是细胞内ATP的主要生产中心，线粒体膜电位（mitochondrial membrane potential，ΔΨm）是由于线粒体内膜两侧质子及其他离子不平衡而形成的，是保持线粒体功能所必需的。在线粒体内、外膜交界处存在一种蛋白性孔道，即膜渗透性转换通道(permeability transition pore，PTP)，多种刺激如氧化应激、超负荷、再灌注损伤等均可造成PTP开放［6］，引起线粒体膜电位的下降，呼吸链断裂，诱导细胞凋亡和死亡。本研究结果显示，经PSO、UVA和PUVA处理的HL-60、NB4细胞线粒体膜电位均有下降，且统计分析结果显示PUVA对细胞线粒体膜电位的影响最强，提示PUVA在诱导HL-60、NB4细胞凋亡的过程中可能影响了PTP的开放，下调了细胞线粒体膜电位水平。

【】
  ［1］ 陈楠楠，黄世林，张德杰，等.补骨脂素加长波紫外线对人白血病细胞株NB4、HL-60、K562作用的研究［J］.中医急症，2007，16（4）：444-446.

［2］ 吴少华，张仲海，赵建斌.补骨脂素体内外抗癌活性的实验研究［J］.中国中药杂志，1998，23（5）：303-305.

［3］ Garneiro LV, Ferreira SR, Chen CL, et al. Psoralen derivatives and longwave ultraviolet irradiation are active in vitro against human melanoma cell line［J］. J Photochem Photobiol B, 2004, 76(1-3):49-53.

［4］ Plumas J, Drillat P, Jacob MC, et al. Extracorporeal photochemotherapy for treatment of clonal T cell proliferations［J］. Bull Cancer, 2003, 90(8-9):63-70.

［5］ Effect T, Fabry U, Osieka R, et al. Induction of apoptosis, depletion of glutathione, and DNA damage by extracorporeal photochemotherapy and psoralen with exposure to UV light in vitro［J］. Anticancer Res, 2001, 21(4A):2777-2783.

［6］ Halestrap AP,Kerr PM,Javadov S,et al. Elucidating the mechanism of the permeability transition pore and its role in reperfusion injury of the heart［J］. Biochim Biophys Acta,1998,1366(1-2):79-94.