免疫应激溃疡性结肠炎模型的建立与评价
作者：李楠 王雪明 稽杨 张林 张虹 宋晶莹 石玉玲
【摘要】 目的 探讨用联合免疫噪声应激法建立大鼠溃疡性结肠炎模型的可行性及价值。方法 将80只Wister大鼠随机分为A、B、C、D四组，每组20只。A组为正常对照组；B组为免疫造模组；C组为噪声应激组；D组为免疫+噪声应激联合组。比较造模后20 d 各组血清皮质醇、结肠组织中MPO、NO水平和结肠组织损伤评分。结果 联合免疫噪声应激法较免疫组、噪声应激组的结肠组织损伤评分、血清皮质醇、结肠组织MPO、NO含量均明显增高。结论 联合免疫噪声应激法建立的溃疡性结肠炎模型持续时间长，优于单一因素，是一种有价值的可行造模方法。
【关键词】 免疫复合法；溃疡性结肠炎；模型；噪声：激素
Foundation and Appreciation of Ulcerative Colonitis Model by Combining Immunizatione with Stress
Abstract： Objective To found and appreciate ulcerative colonitis model by combining immunization with stress. Methods A total of 80 Wister rats were divided into four groups (20 rats per group), i.e. Group A (normal control group), Group B (immunization model group), Group C (noise stress model group) and Group D (immunization plus noise stress model group). Results Tissue lesion score, serum cortisol, tissue myeloperoxidase (MPO) and NO were obviously higher in Group D than in Group B or C.Conclusion The ulcerative colonitis model founded by combining immunization with stress is feasible and better than any of other models.
Key words： ulcerative colonitis; model; immunization; noise; stress
溃疡性结肠炎（UC）素来以病因复杂、难度大、复发率高为特点，且发病率有逐年升高的趋势，已成为临床治疗的一大难题［1］。一种理想动物模型的建立对探索疾病的病因、发病机制、病变具有指导意义，同时也是明确疾病治疗方法及新药开发与研究的前提和保障。目前，国内外对溃疡性结肠炎动物模型建立方法的研究很多，但主要集中在肠道本身黏膜病变及化学影响因子方面，对外界因素的综合考虑较少［2］，已知噪声应激与胃肠疾患关系密切。我们在众多造模方法中，选取了免疫法结合噪声应激法，建立大鼠溃疡性结肠炎模型。并检测大鼠溃疡面积及血清中皮质醇、结肠组织中MPO、NO活性，探讨多因素造模的可行性。
1 材料与方法
1．1 动物分组 80只Wister大鼠随机分为正常对照组(A)、免疫组(B)、噪声应激组(C)和免疫+噪声应激联合组(D)，每组各20只。
1．2 免疫造模方法 二硝基氯苯乙酸模型，大鼠颈背部脱毛，以2%二硝基氯苯(2，4 dinitrochloro．benzene DNCB)液滴背连续7 d 致敏。第8天经肛门插入结肠8 cm 处注入0．04 mmol/L DNCB乙醇液0．25 ml。2周左右出现UC症状，4周左右症状更为严重。
1.3 噪声应激造模方法 使用的噪声源系磁带录制的施工工地电锯切割瓷砖的强噪声， 由录音机输至扬声器发出。实验时大鼠均匀置于隔音室内， 头部正对扬声器，距离25~30 cm。经B＆K2209精密脉冲声级计及频谱分析仪检测噪声主要能量集中在0．25~4．00 kHz，每次校正噪声强度为110dB(A)，暴露时间为上下午各3 h，噪声暴露过程中声压级变化范围不超过1dB(A)。
1．4 组织处理 A、B组大鼠均在无噪声环境下生活，C、D二组大鼠加每天暴露于强噪声下6 h，连续刺激20 d，4组模型分别于10、20 d 经乙醚麻醉后，从眼球静脉取血5 ml，分离血浆，-20 ℃ 下冷冻待测激素。所有大鼠20 d 取血后处死，剖腹，取出结肠沿大弯侧剪开展平，观察溃疡大小，求出其面积。结肠黏膜损伤积分（CMDL），按结肠组织形态学评分标准(见表1)。表1 结肠组织损伤程度评分标准
1．5 多肽激素含量检测 将血样解冻后，采用特异性放射免疫分析法(RIA)测定血浆多肽激素含量。药盒分别由原子能研究院、解放军总提供，按说明书严格进行操作。
1．6 统计学方法 用STATA软件对数据作t检验，P<0.05为有统计学意义。
2 结果
2．1 各组一般情况 造模动物在溃疡性结肠炎形成后均出现腹泻、黏液血便及稀便、少动、毛发无光泽等变化。噪声应激后，联合组症状较免疫和应激组明显加重。D、B组分别死亡各1只，其中B、C二组出现症状有明显差异，B组>C组。
2．2 各组结肠病理变化比较 A组大鼠结肠黏膜完好，无炎细胞浸润及溃疡，黏膜上皮完整、连续，腺体排列整齐，黏膜下固有层内血管纤维组织正常，肌层无异常；C组黏膜充血水肿，上皮坏死脱落，炎性细胞浸润较轻；B组大鼠黏膜表面炎细胞浸润，有糜烂及少量溃疡，黏膜上皮不完整，腺体破坏，个别黏膜下层、肌层有破坏；D组大鼠黏膜表面大量炎细胞浸润，可见大片溃疡面，个别可深达肌层，腺体破坏严重，评分见表2。
2．3 各组结肠组织中MPO、NO活性及血清皮质醇水平比较 见表2。
3 讨论
溃疡性结肠炎的病因尚未明了，近年来开展的化学刺激、免疫学、复合法及CD4+T细胞移植等方法中，研究较深入的主要是自身免疫学说和感染学说；而针对环境及应激因表2 各组结肠组织中MPO、NO活性、血皮质醇水平与CMDI评分比较与A组比较，①P<0.01；与B组比较，②P<0.05
素对UC影响的研究目前相对较少。本研究通过实验发现噪声应激对UC的发生有着重要的作用，而且，噪声应激导致血浆激素水平发生改变，合并免疫作用模型持续较长，更接近理想模型的研究目的。
已证明应激参与许多重大疾病的生成［3］。在强噪声暴露和免疫溃疡等复合因素的作用下，大鼠胃肠内分泌反应产生明显紊乱，因溃疡形成和愈合时相不同以及随着强噪声暴露时间的长短，更使机体发生了复杂多样的内环境失衡，其确切机制和病理生理意义尚难阐明。邹建芳［4］观察了噪声对内分泌腺的影响，证实了噪声这一伤害性传入冲动→下丘脑→垂体→各靶腺内分泌经路的存在，提示噪声对内分泌有直接影响，最终引起慢性损伤，并随时间延长而趋严重。现在已知很多多肽类激素在胃肠道和中枢及外周神经系统中都有分布，故称“脑肠肽”。胃肠道是脊椎动物器官系统中惟一含有整套独特自主的内在神经系统(ENS)的器官，ENS由其所含的神经节及其间的组成，它控制着胃肠道的运动、分泌、血流及水电解质透过上皮的转运等活动，并把胃肠与中枢神经系统(CNS)和植物神经系统(ANS)联系起来。ENS成为ANS中交感和副交感神经系统以外的第三子系统，具有复杂多样的化学递质和（或）调质、反射通路与回路网络，其递质种类（如：肾上腺素、乙酰胆碱、肽类等）几乎与CNS相当。
MPO是主要存在于中性粒细胞中的一种酶［5］。MPO活性是中性粒细胞浸润的重要指标，也是结肠炎严重度的指标。NO是一种广泛存在于机体的生物活性物质，参与炎症过程，而与结肠疾病有密切关系［6］。过量NO不仅趋化中性粒细胞和单核细胞，还使血管扩张，通透性增加，有助于炎症的始动与，且可与超氧阴离子反应生成过氧化亚硝酸盐，损伤上皮细胞的功能和结构，破坏肠道黏膜屏障的完整性。故本研究通过这两个指标的高低来反映UC炎症的严重程度。
本实验中应激组血皮质醇含量和结肠组织中的MPO和NO含量及CMDI相对明显增高并相互呈正相关。显示出噪声应激对溃疡性结肠炎有明显的影响，免疫联合噪声应激也表明能加重溃疡性结肠炎的炎症损伤及溃疡形成。从大鼠的症状及病理观察来看免疫噪声应激联合组病变重于单纯免疫和噪声应激组，且均符合溃疡性结肠炎的临床表现，病理改变与人类患者的病理表现较为一致。
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