研究干扰素-α对肝癌细胞增殖与凋亡的影响

【摘要】  目的：研究干扰素-α对人肝癌SMMC7721细胞的增殖及迁移的抑制作用, 探讨其抗肿瘤作用的机制。方法：常规培养的人肝癌SMMC7721细胞，加入干扰素-α孵育24 h 后，以MTT 法检测干扰素-α对肿瘤细胞增殖的影响; Boyden 小室法检测肝癌细胞侵袭能力的变化，通过Annexin V-FITC检测干扰素-α诱导SMMC7721细胞组的凋亡情况。结果：干扰素-α可以明显抑制体外SMMC7721细胞的增殖，诱导细胞凋亡，导致 Boyden小室穿膜的肿瘤细胞数明显下降。结论：干扰素-α可以直接抑制体外肝癌细胞SMMC7721的增殖和迁移并诱导细胞凋亡。

【关键词】  干扰素-α；细胞增殖和凋亡；侵袭；SMMC7721细胞

    [Abstract]   Objective: To study the inhibitions of the hepatoma cell line SMMC-7721 from proliferation， migration by human interferon-α and the antitumor mechanism. Methods: Hepatoma cell line SMMC-7721 was cultured routinely, and after 24 hours co-incubation of hepatoma cell line SMMC-7721, human interferon-α. MTT assay was used to detect the effects of human interferon-α on proliferation of hepatoma cell line SMMC-7721. Invasive ability of hepatoma cell line SMMC-7721 was examined by Boyden chamber model. Apoptosis in hepatoma cell line SMMC-7721 induced by human interferon-α  was analyzed by annexin V-FITC. Results: Human interferon-α inhibited hepatoma cell line SMMC-7721 from proliferation in vitro and induced its apoptosis  significantly. The number of metastatic tumor cells was significantly reduced. Tumor dimension was also significantly reduced.

    [Keywords]   Interferon-α; Hepatoma; Cell apoptosis; Invasion; SMMC7721 cell line

    干扰素( interferon, IFN)是一组具有多种功能活性的糖蛋白，是由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。根据干扰素蛋白质的氨基酸结构、抗原性和细胞来源，可将其分为IFN-α、IFN-β、IFN-γ 3种亚型。干扰素是一类具有抗病毒、抗增殖及免疫调节作用的细胞因子，对抗病毒性疾病和肝脏恶性肿瘤[1]以及增强机体免疫调节能力有明显效果，国内外已有干扰素作为一种肿瘤的佐剂的相关报道[2，3]。肝细胞癌是一种严重威胁人类健康的恶性肿瘤，而IFN-α对实验性大鼠肝癌及临床肝细胞癌根治性切除术后的转移复发有抑制作用[4]，但干扰素抗肿瘤的机制还不十分清楚。本研究利用人肝癌细胞株SMMC7721细胞建立裸鼠致瘤模型, 并研究IFN-α在体外对肝癌细胞的增殖及侵袭的影响, 初步探讨了其抗肿瘤的机制，以便为IFN-α对于肝癌的临床治疗应用提供理论和实验依据。

    1   材料与方法

    1.1   试剂   人肝癌细胞株SMMC7721购自四川大学基础与法医学院免疫研究所；IFN-α购自江苏曼迪新琴纳医药有限公司；MTT购自美国Sigma公司;流式细胞仪、Boyden 小室及人工基膜(Matrigel) 由北华大学检验系提供。

    1.2   细胞培养   SMMC7721细胞经消化后计数, 以1.5×105个/ml接种96 孔板，每孔加入200 μl，5% 小牛血清的RPMI-1640培养基，平均分为2组：实验组加入含1000 U/ml IFN-α灭菌去离子水溶液50 μl，对照组加入相同体积的PBS, 在5% CO2、37 ℃培养24 h。

    1.3   MTT 法检测SMMC7721细胞的增殖   培养细胞加入MTT（5 mg/ml）50 μl/孔，继续孵育4 h，加入DMSO 100 μl/ 孔, 轻摇10 min 后检测波长A490，每组设10个复孔。细胞增殖的抑制率按照以下公式：（1-IFN-α培养孔细胞上清的A490/对照组培养孔细胞上清的A490）×100%

    1.4   Boyden小室检测细胞侵袭实验   参照Siegal[5]等的体外侵袭实验方法。每张膜随机选取5 个高倍视野, 计数穿过聚碳酸酯膜的细胞数, 每组细胞设10个复孔。穿膜的肿瘤细胞数目多少作为评价肿瘤细胞迁移、浸润能力强弱的指标。

    1.5   Annexin V-FITC细胞凋亡的检测   将处理好的各实验分组的细胞用PBS洗涤2次，离心收集细胞1×105/ml，吸取250 μl的2× Binding Buffer和250 μl灭菌去离子水，混匀后加入1× Binding Buffer 500 μl 悬浮细胞，再加入1 μl Annexin V-FITC混匀后，最后加入5 μl PI混匀，避光室温反应5 min，上机检测。

    1.6   统计学方法   所有数值均以x±s表示，使用Spss 16.0统计软件，组间比较采用配对t 检验，P<0.05 为差异有统计学意义。

    2   结      果

    2.1   MTT 法检测细胞增殖   IFN-α组A490为（0.232±0.043），PBS 组为( 0.351± 0.097) , IFN- α 组与PBS 组比较SMMC7721细胞的增长明显受到抑制（P<0.01），细胞生长的抑制率为23.2%，见图1。

    2.2   Boyden 小室检测细胞体外侵袭功能   IFN-α作用24 h后细胞组穿过Matrigel 发生侵袭的细胞数为每高倍视野（105.2±5.8）个，PBS 组为（151.8±9.5）个，两组比较差异有统计学意义（P<0.01），穿膜细胞的抑制率为25.9%。

    2.3   Annexin V-FITC细胞凋亡的检测   用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡敏感指标Annexin V-FITC，在流式细胞凋亡仪检测的界面上可以分出早期凋亡和晚期凋亡细胞，结果显示IFN-α诱导组细胞凋亡率为（14.23±2.21）%，对照组为（4.22±0.78）%，IFN-α的细胞凋亡率明显高于PBS对照组（P＜0.05）。

    3   讨      论

    IFN-α是一种糖蛋白，属于Ⅰ型干扰素，具有抗病毒、抗肿瘤及免疫调节等多种生物学功能[6]，已被广泛应用于多种领域及多种疾病的中。肝细胞癌是我国常见恶性肿瘤之一，死亡率较高。目前对该病的病因及发病机制认识尚不清楚,有报道在肝细胞癌切除术后应用IFN-α治疗可以降低肝细胞癌的复发[7]，但干扰素抗肿瘤的具体机理尚不清楚。因此本研究利用人肝癌SMMC7721细胞系进行实验，以IFN-α进实验干预，观察研究IFN-α对肝癌细胞的影响。

    本研究中，通过体外MTT实验发现IFN-α可以直接抑制SMMC7721细胞的增殖，增殖抑制率为23.2%。因此，我们可以认为IFN-α对肝细胞癌的生长有显著的抑制作用。

    本研究选用了Boyden chambers 的实验模型, 这一目前测定细胞体外侵袭力的理想模型,来了解IFN-α对肿瘤细胞迁移作用的影响，发现IFN-α作用于SMMC7721细胞后，侵袭能力明显受到抑制,穿膜细胞数明显减少，穿膜细胞的抑制率为25.9%，这表明IFN-α可以在体外实验中抑制细胞的侵袭。

    细胞凋亡与肿瘤的关系仍是目前研究的热点, 细胞的凋亡率直接影响肿瘤的生长状况[9]。我们对体外培养的细胞进行Annexin V-FITC细胞凋亡的检测，通过流式细胞仪检查发现IFN-α的细胞组凋亡率明显高于PBS对照组，差异有统计学意义。

【】
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