表达谱基因芯片筛选前体脂肪细胞分化相关基因的研究

【摘要】  目的:运用基因芯片技术研究前体脂肪细胞分化相关基因表达谱的变化。方法: 体外培养前体脂肪细胞（3T3-L1），诱导分化为成熟脂肪细胞。提取脂肪细胞总RNA , 纯化mRNA 后逆转录制备目标序列, 应用含有45038 种小鼠基因cDNA 的表达谱芯片Mouse430_2进行差异表达谱分析。结果: 在前体脂肪细胞分化的基因表达谱中差异表达基因共有640 条,其中表达水平显著变化的有38条（表达水平改变5倍以上），上调基因24 条,下调基因14 条。差异表达基因中有细胞凋亡相关基因、原癌基因和抑癌基因、细胞信号和传递蛋白基因等多种基因。这些基因可能与脂肪细胞分化相关疾病的发病机制有关。结论:采用基因芯片技术筛选脂肪细胞分化相关基因,可能为脂肪细胞分化相关疾病病因和发病机制的研究提供新思路。

【关键词】  前体脂肪细胞；基因表达；基因芯片

    [Abstract]   Objective: To screen the differently expressed genes during cell  differentiated of adipocyte 3T3-L1 using cDNA microarray. Methods: 3T3-L1 cells were cultured, induce them differentiated, isolate total RNA. Reversely transcripted to cDNAs with fluorescent dUTP to prepare the target sequences , then the target sequences were hybridized to cDNA microarray of 45038 human genes. After washing , the cDNA microarray were scanned for the fluorescent signals and showed differences between 2 kinds of cells. Results: Among 45038 geneprobes , the expression level of 640 genes changed, 38 genes showed dramatically differential expressed profile with 24 upregulated and 14 downregulated genes. The differential expressed genes were related with apoptosis , proto or antioncogene , cell signal conduct , and ytoskeleton , etc. These genes might be related with the pathogenesis of adipocyte differentiation. Conclusion: The investigations based on cDNA microarray can sequence related genes in adipocyte differentiation , and may provide a new idea in studying pathogenesis of adipocyte differentiation.

    [Key words]   3T3-L1 cell ; Gene expression ; cDNA microarray

    脂肪组织不仅是被动的能量储存器官，而且是能够分泌多种激素类物质的内分泌器官；人类多种疾病与脂肪细胞分化及其调控失常有关，包括肥胖症、脂肪肝、高脂血症、糖尿病及乳腺癌等疾病[1]。研究脂肪细胞分化机制及其调控，不仅对研究上述生理和疾病过程机制有重要理论意义，而且对其预防与也具有实际意义。为此, 我们应用基因芯片技术研究3T3-L1细胞分化前后基因表达谱的改变, 全面了解3T3-L1细胞分化所伴发的基因差异表达, 研究3T3-L1细胞分化的产生机制并为寻找相应的干预手段提供理论基础。

    1   材料与方法

    1.1   材料   3T3-L1细胞由本实验室保存，DMEM培养基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、胰蛋白酶和TRIzol由美国Invitrogen公司提供，胰岛素、地塞米松、1-甲基-3-异丁基黄嘌呤(MIX)和油红O(oil red-O)染料由美国Sigma公司提供，One-Cycle cDNA Synthesis Kit、 IVT Labelling Kit、Hybridization,wash and stain Kit、Mouse430_2基因芯片由美国AFFYMETRIX公司提供。

    1.2   方法

    1.2.1   3T3-L1前体脂肪细胞培养和诱导分化   用完全培养液(DMEM+10%FBS+100 U/ml青、链霉素)，在37 ℃孵箱(5%CO2，95%空气)中培养细胞，每2天换液1次。待细胞生长至完全融合后2天(第0天)，开始诱导分化。收集分化前后(0天和10天)的细胞，置-80 ℃冻存备用。

    1.2.2   cDNA的合成及其探针标记   TRizol法提取3T3-L1细胞的总RNA，稀释为1 μg/μl。应用One-Cycle cDNA Synthesis Kit、 IVT Labelling Kit、Hybridization,wash and stain Kit合成cDNA及用探针标记。

    1.2.3   基因芯片方法检测3T3-L1   利用AFFYMETRIX公司的Scan Array 3000 扫描芯片及GCOS 软件对3T3-L1细胞分化前后两种荧光信号的强度和比值进行分析。判定基因显著差异表达的标准: (1) 3T3-L1细胞分化前后信号值其中之一必须>100 ; (2) 3T3-L1细胞分化前后LOG比值>5 为高表达基因, <-5 为低表达基因。

    2   结      果

    2.1   细胞染色结果   诱导分化前，3T3-L1前体脂肪细胞呈梭形，细胞质内未见亮红色颗粒；诱导分化后，细胞形态发生明显变化，细胞逐渐由梭形变为圆形，胞体变大变圆，细胞质内被油红O染成亮红色的脂滴逐渐增多增大，第10天时，可见含有亮红色脂滴的成熟脂肪细胞在视野中占95%以上。

    2.2   3T3-L1细胞分化前后的显著差异表达基因   3T3-L1细胞分化前后中显著差异表达基因共有38 条,其中上调基因为24条,下调基因为14条。在差异表达基因中有细胞凋亡基因、原癌基因和抑癌基因、细胞骨架和运动蛋白相关基因、细胞信号和传递蛋白基因等多种基因参与。

    3   讨      论

    本研究通过3T3-L1前体脂肪细胞体外培养研究发现，3T3-L1前体脂肪细胞的分化过程中，相关基因表达水平有显著变化。由此推测，这些基因参与了脂肪细胞的分化过程。

    基因芯片技术是一种新的基因表达研究方法[2，3]，它利用核酸杂交的原理，在固体支持物上一次检测成百上千乃至上万种基因的表达水平，具有传统方法无可比拟的高通量特点，达到了一定意义上的全基因表达谱的检测。因此，基因芯片技术为了解生命复杂体系提供了技术平台[4]。我们采用基因芯片技术筛选脂肪细胞分化中的差异表达基因,试图初步揭示其发生机制。结果表明:总计发现38 条显著差异表达基因。其中有炎性反应、免疫应答、免疫调控、细胞增殖、凋亡、细胞骨架运动、细胞信号和传递蛋白等多种基因参与，这些均证实脂肪细胞分化的发生是多基因参与的过程。

【】
  [1] Grun F, Blumbeg B. Environment obesogens: Organotins andendocrine disruption via nuclear receptor signaling[J]. Endocrinol.2006，147（Suppl）:S50-S55.

[2] Page GP, Zakharkin SO, Kim K, et al. Microarray analysis[J]. Methods Mol Biol, 2007,404:409-430.

[3] Barla A, Jurman G, Riccadonna S, et al. Machine learning methods for predictive proteomics[J]. Brief Bioinform, 2008， 9(2):119-128.

[4] Wang Y, Miller DJ, Clarke R. Approaches to working in high-dimensional data spaces: gene expression microarrays[J]. Br J Cancer, 2008,98(6):1023-1028.