平喘Ⅰ号对呼吸道合胞病毒哮喘小鼠IL?10、IL?12的影响
作者：杨季国 窦胜冬 徐燕立 林馨 程东庆 冯立
【摘要】 目的］观察平喘Ⅰ号对呼吸道合胞病毒（RSV）感染引起BALB/c小鼠哮喘模型血清中细胞因子IL?10、IL?12水平的影响及其抑制气道炎症反应的作用，探讨平喘Ⅰ号哮喘发作的作用机制。［方法］70只BALB/c小鼠随机分成7组，正常对照组、模型对照组、利巴韦林组、急支糖浆组、平喘Ⅰ号低、中、高剂量组，每组10只。予RSV致敏，除正常对照组和模型对照组用等量生理盐水外，其余各组用相应药物干预。末次激发48h后取肺部标本行常规病理观察，并取血清采用ELISA法测定各组IL?10、IL?12的表达水平。［结果］平喘I号各剂量组较利巴韦林组和急支糖浆组IL?10、IL?12表达水平均有明显升高(P＜0.05）。其中以平喘I号高剂量组升高最为突出。高剂量组较中剂量组和低剂量组对IL?10和IL?12的调节作用更为显著(P＜0.01）。同时，平喘Ⅰ号能明显减少气道浆细胞和嗜酸性粒细胞（EOS）等炎症细胞的浸润。［结论］平喘Ⅰ号能提高哮喘小鼠IL?10、IL?12的表达，抑制支气管哮喘气道炎症，并具有量效关系，由此推测，这种对抗炎因子表达的正性作用是治疗哮喘的作用机制之一。
【关键词】 呼吸道合胞病毒；支气管哮喘；平喘Ⅰ号；IL?10；IL?12
平喘Ⅰ号是临床治疗哮喘急性发作的经验方，该方从中医的“伏痰”理论论治哮喘，以清肺化痰，降逆平喘为治则，通过长期的临床治疗和观察，对哮喘急性发作有明显的控制作用。我们的前期研究发现，该药物确能缓解哮喘症状，并有效控制气道炎症。在此基础上，我们进一步观察平喘Ⅰ号治疗哮喘的效果，观察其对呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytial Virus，RSV）哮喘小鼠IL?10、IL?12表达的影响，以期从多环节、多靶点、多方位探讨平喘Ⅰ号治疗RSV哮喘的作用机制，为中医药防治RSV哮喘提供有力的实验和理论依据。1 材料与方法 1.1 动物及分组 4～6周龄雌性BALB/C小鼠70只，体重14±2g，由浙江中医药大学动物实验中心提供。将小鼠随机分成正常对照组、模型对照组、利巴韦林组、急支糖浆组、平喘Ι号低、中和高剂量组7组，每组10只。
1.2 实验药物 （1）平喘Ⅰ号煎剂。药物组成：旋覆花10g，代赭石20g，葶苈子10g，苏子10g，白芥子10g，炒黄芩10g，竹沥半夏10g，地龙10g，杠板归10g。处方药物由浙江中医药大学第二门诊部中药房提供。所有药物经浸泡、煎熬、过滤及浓缩成浓度为4g/ml生药含量的药汁。（2）利巴韦林颗粒剂（四川百利药业有限责任公司生产）50mg×18袋，用生理盐水配成7.5mg/ml的溶液。（3）急支糖浆，100ml/瓶（太极集团涪陵制药厂生产）。
1.3 主要试剂 （1）福尔马林灭活的呼吸道合胞病毒(FI?RSV)。RSV病毒由浙江省疾病预防控制中心提供，接种于Hep?2细胞上，至病变达到?时收集病毒，福尔马林溶液灭活的RSV病毒。（2）IL?10、IL?12酶联免疫吸附试验（ELISA）所有试剂盒均购于德国eBioscience。（3）氢氧化铝溶液取5％硫酸铝溶液250ml，在强烈的搅拌下加入5％氢氧化钠100ml，用生理盐水离心洗沉淀2次，再悬入生理盐水中使达250ml［8］。同时取适量加等容积抗原（蛋白质含量25mg/ml）。
1.4 造模及给药 除正常组外的各组小鼠以0.1ml致敏液（FI?RSV和AL(OH)3佐剂1：1）腹腔注射致敏，第8天再次致敏，第21天小鼠经戊巴比妥麻醉后用FI?RSV液滴鼻激发哮喘。正常组以等量生理盐水代替FI?RSV。第8天致敏后，平喘Ι号低、中、高剂量组分别以20g、40g、80g/kg/d灌胃；利巴韦林对照组给予75mg/（kg·d）灌胃，急支糖浆对照组给予15ml/kg/d灌胃，正常组及模型组均给予等容量的生理盐水灌胃。每日1次，连续给药14天。
1.5 血清IL?10、IL?12含量测定。末次激发24小时后，摘小鼠眼球取血0.4ml左右，室温静置1～2h，以2500r/min离心15min，取0.1ml血清分装于无热源和内毒素的塑料试管中，封口后保存在-80℃冰箱中，待测IL?10、IL?12。按ELISA操作说明书上的检测步骤进行IL?10、IL?12含量的测定。
1.6 肺组织病观察。各组小鼠于末次激发24小时后依次处死小鼠，行胸腔切开，剪取每只小鼠左肺，浸泡于4％福尔马林溶液中固定，常规脱水，石蜡包埋切片，HE染色，采用德国LeicaQ500MC图像分析系统，观察支气管黏膜嗜酸性粒细胞（EOS）浸润、水肿和上皮损伤程度。
1.7 统计方法 实验数据用SPSS12.0软件进行统计处理。计量资料以均数±标准差(x±s)表示，计量资料两组间均数比较用t检验，多组间均数比较用F检验。以P＜0.05或P＜0.01为差异的显著性标准。
2 结果
2.1 RSV致敏小鼠哮喘发作时的大体观察 致敏小鼠激发后普遍表现为呼吸急促、缩肩拱背，严重者出现呼吸节律减慢或节律不整、发出喘鸣音、腹肌抽搐、小便失禁等症状。正常对照组无症状。
2.2 平喘Ⅰ号对哮喘小鼠肺组织病理学变化的影响 正常组小鼠肺组织切片未见明显病理性损伤。模型对照组小鼠肺组织切片可见以嗜酸粒细胞、嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞为主的炎性细胞聚集在终末细支气管以及血管周围。支气管上皮脱落，有少数炎症细胞渗入支气管腔内。利巴韦林组炎症细胞灶性增多，支气管旁散在炎症细胞浸润，肺泡部分区域可见正常肺泡，近支气管壁旁肺泡间隔内可见少许炎症细胞浸润。急支糖浆组支气管壁以及肺泡壁内淋巴细胞、浆细胞浸润较多，并可见血管内中性粒细胞靠边，支气管腔内可见少量炎症细胞。平喘I号低剂量组支气管壁以及肺泡间隔可见散在炎症细胞浸润，支气管壁结构完整，支气管黏膜上皮有轻到中度损伤。中剂量组支气管壁可见散在淋巴细胞浸润，灶型淋巴细胞浸润较多，器官结构完整，粘膜无脱落，无水肿。高剂量组小鼠肺组织切片显示炎症明显好转，支气管及支气管黏膜下可见轻度炎性细胞浸润，偶见少许嗜酸性粒细胞浸润，支气管黏膜上皮基本完整，轻度水肿。
2.3 平喘Ⅰ号对哮喘鼠血清IL?10和IL?12的影响 由表1可见，模型对照组血清IL?10和IL?12含量明显降低。平喘I号各剂量组IL?10和IL?12表达明显上调。其中，以高剂量组作用最为突出：IL?10的表达明显高于利巴韦林组和急支糖浆组(P＜0.01)，IL?12的表达优于利巴韦林组和急支糖浆组(P＜0.05)。
表1 各组哮喘小鼠血清中IL?10和IL?12的表达水平（略）
与模型对照组比较，*P＜0.05；与利巴韦林组比较△P＜0.05，△△P＜0.01；与急支糖浆组比较▼P＜0.05，▼▼P＜0.01
3 讨论
哮喘的主要病因在于宿痰内伏于肺。在此基础上复因感受风寒、风热之邪等众多外部因素，导致外邪引动伏痰，痰随气升，气因痰阻，相互搏结，阻塞气道，气机升降不利，以致呼多吸少，气息喘促，吼哮痰鸣，发为哮喘。哮喘的，后世医家多尊崇元代朱丹溪所提出的哮证已发，攻邪为主，未发则以扶正为主的治疗理念。根据这一指导思想，平喘I号便以化痰平喘利气兼清热为治疗原则。通过长期的临床治疗和观察，证实对小儿哮喘发作有明显的治疗作用。平喘Ι号方主要由《伤寒论》旋覆代赭汤合《韩氏医通》三子养亲汤加减化裁而成。根据哮喘发作的病因病机，平喘Ι号减两者补益和消积之效，而重取其化痰降逆平喘之功。方中旋覆花性温而能消痰下气，降逆以调气机；代赭石质重而沉降，善镇冲逆，肃肺降逆平喘，其味苦气寒可制旋覆花之温；两药相合，寒热共调，痰消逆降。白芥子功在利气豁痰，同时具有健胃功能；苏子降气化痰；易消食导滞之莱菔子为葶苈子以泻肺行水消痰；三者共奏止咳平喘之功。半夏燥湿化痰，经竹沥炮制后制其温性且增其涤顽痰之效；与黄芩配合辛开苦降，清肺化痰。地龙解痉、通络、清热、平喘；杠板归宣肺解痉，化痰平喘。纵观全方，清肃豁痰，解痉平喘，内外兼顾，从而达到控制哮喘急性发作的目的。
IL?10是具有多项生物学活性的强力免疫抑制因子，其不仅可抑制Th0，Th1，Th2细胞分泌的细胞因子，还可抑制巨噬细胞、T细胞和NK细胞的功能。哮喘是一种慢性气道炎症疾病，因此，作为一种免疫抑制因子，IL?10在哮喘的控制中起着重要作用。研究发现，中药平喘Ⅰ号能明显提高IL?10的表达。可见，平喘Ⅰ号可通过影响IL?10，对Th1/Th2机制进行调节，从而对哮喘产生治疗作用。
IL?12的最重要功能是诱导Th0细胞向Th1分化，抑制其向Th2细胞分化，是Th1细胞产生的必需因子［1］。Lewkowich等［2］人在实验中发现，在调节性T细胞衰竭小鼠中，伴随着刺激性T细胞分化增多和Th2细胞因子的产生，IL?12表达下降。这与气道高反应性的改变相同。我国武汉大学的研究人员认为［3］，变应性哮喘患者成熟的树突状细胞在CD86表达增强和IL?12、IL?10生成减少的情况下，会优先启动初始T细胞向Th2方向转化。从而使机体趋向于Th2型免疫反应。
现在已有相关研究，利用IL?12来治疗哮喘。但是全身应用IL?12不仅价格昂贵、副作用大，而且作用难以持久。我们的实验结果表明，平喘Ⅰ号可有效提高RSV哮喘鼠IL?12的表达水平，且效果优于利巴韦林和急支糖浆。由此看来，平喘Ⅰ号是通过对哮喘小鼠IL?12的影响来降低气道高反应性、调节Th1/Th2细胞平衡以达到控制哮喘的目的。
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1］ De Becker G，Moulin V，Tielemans F.Regulation of T helper cell differentiation in vivo by soluble and membrane proteins provided by antigen?presenting cells［J］.Eur J Immunol，1998，28(10)：3161?3171.
［2］ Lewkowich IP，Herman NS，Schleifer KW.CD4+CD25+ T cells protect against experimentally induced asthma and alter pulmonary dendritic cell phenotype and function［J］.J Exp Med，2005，202(11)：1549?1561.
［3］ Chen XQ，Yang J，Hu SP.Increased expression of CD86 and reduced production of IL?12 and IL?10 by monocyte?derived dendritic cells from allergic asthmatics and their effects on Th1? and Th2?type cytokine balance［J］.Respiration，2006，73(1)：34?40.
