免疫介导型再生障碍性贫血小鼠间充质干细胞成骨及成脂潜能改变

             作者：高瑞兰 尹利明 钱煦岱 林筱洁 陈小红 王潇

【摘要】  目的］探讨免疫介导型再生障碍性贫血小鼠间充质干细胞（msenchymal stem cell，MSC）向成骨及成脂肪细胞分化潜能的改变。［方法］采用免疫介导法进行再障造模，Babl/c小鼠经60Co射线亚致死剂量照射后，自尾静脉输入DBA/2小鼠的淋巴细胞建立免疫介导型再生障碍性贫血小鼠模型；造模15天后进行再生障碍性贫血小鼠骨髓间充质干细胞培养，并检测骨髓成纤维细胞集落形成单位（CFU?F）数量变化，观察模型小鼠骨髓病理改变；茜素红和油红O分别检测模型小鼠MSC钙结节数和脂肪细胞形成率。［结果］再障模型小鼠CFU?F数明显减少；骨髓病理切片显示，造血组织减少，并脂肪化；再障小鼠MSC钙结节数量减少，脂肪细胞分化率显著增加。［结论］免疫介导再生障碍性贫血小鼠MSC成骨潜能减弱，成脂潜能明显增强。

【关键词】  再生障碍性贫血；骨髓间充质干细胞；成骨潜能；成脂潜能

　　骨髓间充质干细胞是造血微环境的重要组成细胞，其生物特性的改变将影响骨髓造血，有研究表明再生障碍性贫血患儿MSC增殖能力弱于正常患儿［1］，但至今尚未见MSC与再生障碍性贫血发病机理的相关报道。因此，本研究通过探讨再生障碍性贫血模型小鼠骨髓MSC向成骨细胞以及脂肪细胞分化潜能的改变，期望为进一步阐明再生障碍性贫血的发病机理提供一定的理论基础。1  材料　　1.1  动物  Babl/c小鼠（18～22g，雌雄不限）50只，作为再生障碍性贫血模型（aplastic anemia ，AA）载体。DBA/2小鼠（18～22g，雌雄不限）5只，作为再障模型免疫活性细胞供体（均由浙江中医药大学动物中心提供）。

　　1.2  主要试剂  荧光素标记大鼠抗小鼠抗体：CD29?PE，CD44?PE，CD45?FITC及相关同型对照抗体购于eBioscience公司（美国）。胎牛血清（FBS）购自杭州四季青生物工程公司。茜素红、油红O均购自Sigma（美国）。

　　2  方法

　　2.1  骨髓间充质干细胞培养  颈椎脱臼处死Babl/c小鼠，用75%的乙醇浸泡10min，无菌条件下取出双侧下肢骨，DMEM培养液冲骨髓，过4、6号针头制成单细胞悬液，1500转/分离心洗涤两次后，计数调整细胞浓度，用含10%胎牛血清、青霉素和链霉素各100U/ml的L?DMEM培养液重悬，按照1×107细胞/cm2接种于培养皿中，并置于于37℃、5%CO2及饱和湿度的恒温箱中进行培养，72h首次换液，以后3至4天换液一次，当达到80%融合时用0.25%胰酶消化进行传代，根据所到细胞数按1∶1或1∶2进行传代纯化培养。以下实验均采用纯化的第4代贴壁细胞。

　　2.2  MSC表面抗原鉴定  胰蛋白酶消化法收集上述贴壁细胞，分别与抗小鼠的CD29?PE、CD44?PE和CD45?FITC抗体及相关同型对照室抗体温孵育15min后，PBS洗涤1次，流式细胞术检测贴壁细胞表面分子表达情况。实验重复3次，以确立骨髓间充质干细胞培养体系。

　　2.3  免疫介导再生障碍性贫血模型建立  按照本研究室建立的方法［2］。先制备供体的胸腺和淋巴细胞悬液：DBA/2小鼠，颈椎脱臼处死，无菌取出胸腺及颈部、颌下、腋窝、腹股沟及肠系膜等处的淋巴结。置200目的不锈钢过滤网上，轻轻捣碎研磨，生理盐水冲洗，收集单细胞悬液。计数后，胎盘蓝拒染，活细胞>95%，调整细胞浓度至5×106/L。Babl/c小鼠经60Coγ射线（1.0Gy，5min）全身均匀照射后，于4h内自尾静脉输入供鼠的淋巴细胞106/只。

　　2.4  成骨细胞培养及鉴定  取第4代MSC，接种于六孔板，2×105细胞/孔，当细胞贴壁生长达60％～70％融合时，吸去孔中培养液，加入成骨细胞诱导液（含L?DMEM、10%FBS、10-8M/L地塞米松、10-2M/Lβ?甘油磷酸钠、50mg/L抗坏血酸），每3d换一次液。培养2～3周后。去除培养液，PBS洗两次，95%乙醇固定10min，蒸馏水洗3次，加入0.1%茜素红，37℃染色30min，去除染液，蒸馏水冲洗后，即在显微镜下观察钙结节。

　　2.5  成脂肪细胞培养及鉴定  取第4代MSC，接种于六孔板，4×105细胞/孔，当细胞贴壁生长达80％融合时，吸去孔中培养液，加入成脂肪细胞诱导液（含L?DMEM、10%FBS、0.25×10-6M/L地塞米松、50×10-6M/L吲哚美辛、0.5×10-3M/L 3?异丁基?1?甲基黄嘌呤、10×10-3g/L胰岛素）进行诱导培养，每3d换1次液。培养2～3周后，吸去培养液，PBS洗3遍，用10%甲醛固定细胞10min，蒸馏水漂洗，然后2%油红O染液室温染色20-30min，去除染液，PBS洗2次，苏木素复染后，显微镜下观察3个不同视野并计数200个细胞，统计脂肪细胞分化率。

　　2.6  成纤维细胞集落形成单位（CFU?F）培养  骨髓单个核细胞重悬于含20%胎牛血清的DMEM培养基中，并调整细胞浓度为1×106/ml，接种于24孔培养板中，1ml/孔，置于37℃、5%CO2饱和湿度恒温箱中培养，培养7天后，PBS洗两遍，瑞士-吉姆萨染色，显微镜下观察，以大于10个成纤维细胞的聚合为一个集落，并计数每孔的集落数。

　　2.7  骨髓病理切片  取小鼠双侧下肢骨，置于苦味酸-多聚甲醛固定液中，固定24～48h后，稀盐酸中脱钙4～6h后，进行脱水、浸蜡、包埋、切片，HE染色后在光学显微镜下观察骨髓造血组织增生情况。

　　2.8  统计学处理  利用SPSS 11.5统计软件包进行统计，各组数据以均数±标准差(x±s)来表示，组间比较用t检验。

　　3  结果

　　3.1  骨髓间充质干细胞培养及鉴定  正常Babl/c小鼠骨髓单个核细胞种入培养瓶培养3d后，倒置显微镜观察，可见集落样生长的贴壁细胞，细胞形态不均一，7天左右即可融合为单层。传代细胞形态均一，以梭形为主，经3～4次传代后贴壁细胞可以获得纯化。流式细胞仪测定第4代MSC细胞免疫表型，结果显示CD44表达为（99.6±4.3）%，CD29±表达为（98.8±8.9）%；CD45阴性表达（见图1）。     

　　A.CD29?PEB.CD44?PEC.CD45?FITC

　　图1  Babl/c小鼠第4代MSC表面抗原流式细胞术分析（略）

　　3.2  免疫介导再生障碍性贫血小鼠模型的建立  按照本研究室方法建立的模型，均于造模后4天出现贫血症状。正常小鼠骨髓造血结构完整，造血组织丰富；模型小鼠骨髓造血结构破坏，造血细胞减少，脂肪化（见图2）。
   
　　A，正常小鼠造血组织结构完整，造血细胞分布均匀，造血细胞增殖旺盛；B，模型小鼠造血结构破坏，造血细胞减少，造血组织被大量的脂肪组织代替。

　　图2  正常小鼠和模型小鼠骨髓病理（略）

　　3.3  成骨细胞诱导培养及茜素红染色鉴定  第4代MSC在成骨细胞培养基诱导条件下，连续培养5天可见细胞复层生长，局部增厚，细胞集落中心出现沉积物，继续培养出现肉眼可见的结节，14天后茜素红染色，沉积物被茜素红染为深红色，即为钙盐特征性染色（见图3）。再障模型小鼠MSC细胞复层生长缓慢，钙结节数量少于正常小鼠（见表1）。
 
　　A.正常小鼠MSC分化的钙结节；B模型小鼠MSC分化的钙结节。

　　图3  MSC成骨潜能改变（×100）（略）

　　MSC经成骨细胞诱导培养液诱导14天后，茜素红染色观察钙结节数量。

　　3.4  成脂细胞诱导培养及油红“O”染色鉴定  正常小鼠和再障小鼠第4代MSC分别用脂肪细胞培养基进行诱导培养，再障小鼠诱导形成的脂肪滴出现时间（7天）早于正常小鼠（10天），继续诱导培养，脂肪滴明显增大并发生融合。诱导21天后，油红O染色，融合的脂肪滴被油红O染色为明亮的红色（见图4），苏木素复染细胞核染成蓝色，在正直显微镜下选择3个不同视野计数200个细胞，脂肪细胞诱导率，再障小鼠MSC向脂肪细胞诱导分化率明显高于正常小鼠MSC（见表1）。
   
　　A.正常小鼠MSC分化的脂肪细胞；B.模型小鼠MSC分化的脂肪细胞。

　　图4  MSC成脂肪细胞分化潜能改变（×400）（略）

　　MSC经成脂肪细胞诱导培养液诱导培养21天后，油红O染色后苏木素复染，观察脂肪细胞分化率。3.5  CFU?F培养  体外CFU?F培养可以直接反应体内MSC数量，再生障碍性贫血小鼠CFU?F数量明显低于正常小鼠（见表1）。

　　表1  正常小鼠与再障模型小鼠CFU?F数量和分化能力的比较（略）

　　与正常小鼠比较，**P＜0.01

　　4  讨论
   
　　近年来对间充质干细胞的研究已经比较深入，并且对于间充质干细胞的特性改变是否参与疾病的发生也在积极的讨论中，并取得了一些结果，本研究发现模拟再生障碍性贫血的模型小鼠CFU?F数量减少，成骨能力降低，成脂能力增强。
   
　　CFU?F可以反应体内MSC的数量［3］，因此可以作为MSC数量的检测方法。本研究发现，免疫再障小鼠CFU?F数量低于正常小鼠，表明免疫再障小鼠MSC数量较少，但是是否是再障发生的始动因素还需进一步研究。
   
　　间充质干细胞具有多向分化潜能，在不同诱导条件下，可以诱导形成成骨细胞、脂肪细胞、神经细胞等其他类型的细胞。成骨细胞不仅是骨骼系统重要组成细胞而且是造血“壁龛”重要组成细胞［4］，因此成骨细胞的质和量直接影响骨骼系统和造血系统。本研究发现再障模型小鼠间充质干细胞向成骨细胞分化障碍，钙结节数量减少，可以推断再障模型小鼠骨髓成骨细胞数量减少，造血“壁龛”数量减少，从而造血干、祖细胞增殖分化的场所减少，导致骨髓组织中造血细胞减少。再障小鼠骨髓病理切片显示：造血组织减少，脂肪化。骨髓的脂肪细胞由间充质干细胞分化而来，模型小鼠MSC向脂肪细胞分化能力增强，导致骨髓脂肪化。关于骨髓间充质干细胞分化能力改变的始动因素仍需进一步研究。

【】
  1］ 陈静，王茜，施英唐，等.再生障碍性贫血患儿骨髓间充质干细胞的生物学特点［M］.实验血液学杂志,2005，13（5）：832?838.

　　［2］ 盖云，高瑞兰，牛泱平，等.三七皂苷对免疫介导型再生障碍性贫血小鼠造血祖细胞的增殖作用［M］.中国中西医结合杂志,2003，23（9）：680?683.

　　［3］ Prockop D J.Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues［J］.Science，1997,276：71?74.

　　［4］ Zhang J，Niu C，Ye L，et al.Identification of haematoipoietic stem cell niche and control of the niche size［J］.Nature，2003，425,836?841.