中药蛇六谷石油醚萃取物对小鼠H22肝癌移植瘤抑制作用的实验研究
作者：陈培丰 吴巧凤 倪桂宝 潘磊 徐国暑
【摘要】 目的］建立小鼠H22肝癌移植瘤模型，研究中药蛇六谷石油醚萃取物对其生长的抑制作用，并初步探讨其可能的作用机理。［方法］以皮下接种H22肝癌细胞的荷瘤小鼠为模型，进行蛇六谷不同提取物的体内抑瘤实验，观察抑瘤率、与5?Fu的协同抑瘤作用；流式细胞仪检测蛇六谷石油醚萃取物对小鼠H22肝癌细胞凋亡的影响；免疫组织化学方法检测蛇六谷石油醚萃取物对荷瘤小鼠H22肝癌细胞生存素（Survivin蛋白）、Bcl?2相关蛋白X(Bcl?2 associated protein x，Bax蛋白)表达的影响。［结果］蛇六谷石油醚萃取物对小鼠H22肝癌移植瘤的生长具有一定的抑制作用，其机理可能与降低小鼠H22肝癌移植肿瘤Survivin蛋白的表达、上调Bax蛋白的表达，从而促进H22肝癌细胞凋亡相关。
【关键词】 蛇六谷；H22肝癌细胞；抑瘤率；凋亡；Survivin蛋白；Bax蛋白 中药蛇六谷是天南星科魔芋属（Amorphophallus）的多年生草本植物的统称，又名魔芋。据《中药大辞典》［1］记载：本品性寒味辛、苦，内服有化痰消积、解毒散结、行瘀止痛的功效。广泛用治各种恶性肿瘤，有软坚散结、解毒抗癌作用，在肿瘤转移时，往往更重用该药并取得明显的疗效。前期实验结果显示，蛇六谷提取物对体外培养的人胃癌SGC?7901细胞［1］、肝癌HepG?2细胞和大鼠胶质瘤C6细胞均有较强的抑制增殖作用，且其机理可能与肿瘤细胞周期阻滞和诱导肿瘤细胞凋亡相关。本实验将系统溶剂法初步提取分离的蛇六谷石油醚萃取物进行体内抑瘤实验，研究其体内的抑瘤作用，并探讨其抗肿瘤作用的可能机理。
1 材料与方法
1.1 材料 （1）实验材料：蛇六谷，购自浙江中医药大学附属第一中药房，产地为浙江临安，经该院徐锡山主任药师鉴定为天南星科（Araceae）魔芋属花魔芋（Amorphophallus Konjac K.Koch）的干燥块茎。5?氟尿嘧啶/Fluorouracil：10ml：0.25g，江苏南通精华制药有限公司，批号060602。（2）细胞株：人肝癌H22细胞株，购自院上海细胞生物学研究所。（3）实验动物：昆明种小鼠，雄性，体重18～22g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，许可证号：SCXK（沪）2003?0003。（4）主要仪器：SHZ?D（Ⅲ）循环水式真空泵、SENCO R?201旋转蒸发仪、AR2130精密天平、DGG?9070A电热恒温鼓风干燥箱、滩片机HI1210、轮转式切片机RM2135、石蜡切片刀架RM2135、切片漂烘温控仪QP?B2、隔水式恒温培养箱37℃GNP?9050型、EPICS XL型流式细胞仪、OLYMPUS?BX50显微镜等。（5）实验试剂：碘化丙啶(PI)：杭州昊天生物技术有限公司（进口分装）；Annexin V?FITC试剂盒：南京博泰生物技术有限公司；兔二步法检测试剂盒、SURVIVIN免疫组化试剂盒、BAX免疫组化试剂盒：北京中杉金桥生物技术有限公司；多聚赖氨酸（10x）：北京中杉金桥生物技术有限公司；乙醇、石油醚、乙酸乙酯等均为分析纯。
1.2 方法
1.2.1 蛇六谷石油醚萃取物的制备和配置：方法［2］，精密称取干燥的蛇六谷饮片200g，粉碎成粗颗粒，95％乙醇浸泡过夜后回流提取。提取液减压浓缩，回收乙醇后以石油醚萃取，回收萃取试剂后得石油醚萃取物，提取成分过滤除菌，浓缩至浸膏，得蛇六谷石油醚萃取物。
1.2.2 人肝癌H22细胞株的培养和制备：细胞悬液的制备采用RPMI?1640完全培养基，置于37℃、5％CO2培养箱内，取对数生长期的细胞，用0.25％胰蛋白酶(含0.01%EDTA)消化，制成细胞悬液0.1ml，含细胞数1×106个，台盼蓝测定细胞活力在95%以上。
1.2.3 小鼠荷H22肝癌移植瘤模型的建立：参考文献方法［3］，H22肝癌细胞株腹水在小鼠体内传代3次，取腹水（乳白色）适量用PBS液以1∶4稀释混匀制成癌细胞悬液，调整癌细胞浓度为1×107/ml，各取0.2ml癌细胞悬液接种在昆明种小鼠右前腋皮下。接种24h后，随机分为5组：空白对照组，阳性对照组，蛇六谷石油醚萃取物高剂量组、中剂量组、低剂量组，每组各10只。于第二天开始灌胃给药，中药各组给药体积均为0.2ml/10g体重，空白对照组予0.2ml/10g体重的蒸馏水，阳性对照组予0.2ml/10g体重的5?Fu（25mg/kg）液，药物合用组予0.2ml/10g的石油醚萃取物高剂量的药物和0.2ml/10g的5?Fu液。并每天在灌胃前定时称体重，连续10d。第11天时，称体重，然后用脱颈臼法处死小鼠，剥取皮下瘤块，肿瘤组织取部分用于流式细胞检测，剩余标本经10%福尔马林固定，石蜡包埋切片，免疫组化检测蛋白表达。
2 实验结果
2.1 蛇六谷石油醚萃取物对荷H22小鼠肿瘤生长的抑制作用 实验结果显示（表1）：石油醚萃取物的抑瘤作用随着药物浓度的提高逐渐增强，呈现一定剂量－效应关系；高剂量组的抑瘤率与5?Fu组相当，与5?Fu组比较，瘤重差异无显著性（P＞0.05）。高、中、低剂量组及合用组与空白对照组比较，瘤重差异有显著性(P＜0.05)，高、中、低剂量组间比较，瘤重差异无显著性(P＞0.05)。5?Fu组与空白对照组比较，瘤重差异有显著性(P＜0.05)。
表1 小鼠H22肝癌移植瘤生长的抑制作用（略）
与生理盐水对照组相比，*P＜0.05
2.2 流式细胞仪检测蛇六谷石油醚萃取物对小鼠H22肝癌移植瘤细胞凋亡率的影响 实验结果显示（表2、图1）：石油醚萃取物高、中剂量组、5?Fu组、药物合用组与空白对照组比较，肿瘤细胞凋亡率差异有非常显著性（P＜0.01）；药物合用组与石油醚萃取物中剂量组比较，差异有显著性（P＜0.05），与低剂量组比较，差异有非常显著性（P＜0.01）。
表2 对小鼠H22肝癌移植瘤细胞的凋亡率的影响（略）
与生理盐水对照组相比，*P＜0.01A石油醚萃取物高剂量组B石油醚萃取物中剂量组C石油醚萃取物低剂量组D空白对照组E 5?Fu对照组F药物合用组
图1 流式细胞仪术检测石油醚萃取物对小鼠H22肝癌细胞凋亡率的影响（略）
2.3 蛇六谷石油醚萃取物对小鼠H22肝癌移植瘤生存素（Survivin蛋白）表达的影响 实验结果显示（表3、图2）：蛇六谷石油醚萃取物组、药物合用组，能够下调Survivin蛋白表达，且与空白对照组比较，差异有非常显著性(P＜0.01)；5?Fu组也能下调Survivin蛋白表达，与空白对照组比较，差异有显著性(P＜0.05)。
表3 对小鼠H22肝癌移植瘤Survivin蛋白表达的影响（略）
与空白对照组比较，*P＜0.01；△P＜0.05
Survivin阳性表达（400倍） Survivin阴性表达（400倍）
Survivin阳性表达图中可见，细胞浆中可以看到较多的棕黄色颗粒状，少数细胞核同时也可见到棕黄色颗粒状，同时可以看到蓝色的淋巴细胞。Survivin阴性表达图中，看到肿瘤细胞中出现棕黄色的颗粒很少，或没有。
图2 小鼠H22肝癌移植瘤组织中Survivin蛋白阳性与阴性表达（略）
2.4 蛇六谷石油醚萃取物对小鼠H22肝癌移植瘤Bcl?2相关蛋白X（Bax蛋白）表达的影响 实验结果显示(表4、图3)：蛇六谷石油醚萃取物组能够上调Bax蛋白表达，且与空白对照组比较，差异有非常显著性(P＜0.01)；5?Fu组、药物合用组也能上调Bax蛋白表达，与空白对照组比较，差异有显著性(P＜0.05)。
表4 对小鼠H22肝癌移植瘤Bax蛋白表达的影响（略）
与空白对照组比较，*P＜0.01；△P＜0.05
Bax阳性表达（400倍） Bax阴性表达（400倍）
Bax阳性表达图中可见，有较多的细胞浆出现棕黄色颗粒，同时有片状坏死组织；Bax阴性表达图中，细胞浆出现棕黄色颗粒的细胞很少。
图3 小鼠H22肝癌移植瘤组织中Bax蛋白阳性与阴性表达（略）
3 讨论
3.1 我们前期采用体外细胞实验筛选的方法［1］，发现蛇六谷抗肿瘤成分可能为系统溶剂法提取分离后的石油醚成分，为了进一步研究并验证其体内作用的结果，本实验对该成分的体内抗肿瘤机理进行研究。结果显示蛇六谷石油醚萃取物对小鼠H22肝癌移植瘤的生长具有一定的抑制作用，与体外实验的结果具有一致性。本次实验亦显示了高剂量蛇六谷石油醚萃取物联合5?Fu对小鼠H22肝癌移植瘤的抑瘤率虽较两药单独使用有提高，但三组间两两比较，瘤重差异无显著性（P＞0.05）。同时根据Burgi修正公式［4］，提示两者亦无协同抑瘤作用。其中机制尚不十分明确，需要进一步研究。
3.2 自从细胞凋亡概念提出后，目前凋亡研究已渗透到生物学、基础医学、临床和药物筛选等许多领域，特别是凋亡与肿瘤发病机制及肿瘤治疗研究已成为当今医学界肿瘤研究的热点之一。并且使人们认识到肿瘤的发生是由于肿瘤细胞的生长与凋亡失衡造成的，因此诱导凋亡也可作为肿瘤疗效评价的一项新指标［5］。我们认为，蛇六谷石油醚萃取物具有一定的诱导肿瘤细胞凋亡的作用，可能为该成分抗肿瘤作用的主要机理之一。
3.3 Survivin即生存素，是新近发现的一种凋亡抑制基因，哺乳类凋亡抑制蛋白IAP家族的新成员［6］。蛇六谷石油醚萃取物引起肿瘤细胞凋亡的一个机理可能是通过下调Survivin蛋白的表达来实现。同时药物合用组显著降低小鼠H22肝癌移植肿瘤的Survivin蛋白表达的机理也值得深入研究。
3.4 目前认为，Bax基因是极重要的促细胞凋亡的基因之一，它可能是通过形成Bcl?2－Bax复合物或通过其它Bcl?2作用靶的竞争来实现的。带少量Bax的细胞只需低水平的Bcl?2即可达到形成Bcl?2－Bax的严格化学剂量，从而终止细胞凋亡的发生，相反，若Bax水平较高，可能形成较多的Bax同源二聚体，从而加速细胞凋亡的发生。根据本实验结果我们推测，蛇六谷石油醚萃取物能通过提高Bax基因的表达，促进H22肝癌细胞的凋亡，但是否通过形成Bcl?2－Bax复合物或通过其它Bcl?2作用靶点的竞争来实现促进凋亡，尚有待进一步研究。
【】
1］ 陈培丰.中药蛇六谷提取物对人胃癌SGC?7901细胞增殖影响的实验研究［J］.中华中医药学刊，2008，26（11）：2313?2316.
［2］ 王爱武.猫爪草提取物体外抗肿瘤作用的研究［J］.天然产物研究与开发，2004，16（6）：529?530.
［3］ 王伯坛.病技术［M］.北京：人民卫生出版社，2006.
［4］ 徐向毅，唐丽华，梁中琴，等.珍珠菜提取物抗肿瘤作用的初步研究［J］.野生植物资源，2003，22（2）：31?34.
［5］ Altieri DC.Survivin，versatile modulation of cell division and apoptosis in cancer［J］.Oncogene，2003，22：8581.
［6］ Ambmsini G，Adida C，Altieri DC.A novel anti?apoptosis gene，survivin，expressed in cancer and lymphoma［J］.Nat Med，1997，3(8)：917?921.
