线栓大鼠大脑中动脉缺血模型制作方法的改进

                  作者：吴培要, 王 静, 谢丽芬, 张贵林, 任光友 

【关键词】  大脑中动脉，脑缺血； 模型，动物； 大鼠，Sprague-Dauley； 改良线栓法

缺血性脑血管病的基础研究需要建立简便有效的动物模型，制备局灶性脑缺血模型的方法有很多种，常用的有经颞下或经眶入路夹闭或电凝大脑中动脉(MCA)、光化学诱导血栓形成等。目前，国内外广泛应用的另一种方法是颈内动脉(ICA)线栓法。可逆性线栓大鼠大脑中动脉缺血模型适于脑梗死缺血半暗区病理生理研究、影像学研究、缺血再灌注损伤机制和脑保护药物研究。但是，据国外报道，可逆性线栓大鼠大脑中动脉缺血模型制作成功率不高（为30%～70%），且模型的神经功能评分变异较大[1]。鉴于此，在经多次预试验的实践基础上，对可逆性线栓大鼠大脑中动脉缺血模型制作进行改进，以图提高其成功率和稳定性，增加实验结果的可靠性。

    1  材料与方法    

    1.1  实验材料

    　　显微镊、手术刀、止血钳、微动脉夹、尼龙线、开口器、大鼠固定器、油性记号笔、直尺等。水合氯醛 （AR，天津市大茂化学试剂厂，批号：20070403）；SPF级 SD大鼠60 只，雌雄兼用，体重280～320 g，由重庆市中药研究院动物中心提供，许可证号：SCXK（渝）2007-0006[2]。

    1.2  实验方法

    1.2.1  栓子制作  将尼龙线剪成长4~5 cm 线段，一端加热呈圆球状（直径0.28 mm左右）制成栓子[1，3]。用黑色油性记号笔在圆球头端及距离圆球头端1.8~2.0处各作一记号备用。

    1.2.2  动物分组  将60只大鼠随机分成传统方法组和改良方法组，每组30只。

    1.2.3  模型制作  传统方法制作模型（传统组）：大鼠麻醉（腹腔注射10% 水合氯醛，0.35 ml/100 g[4])，取颈正中切口，撕裂胸骨舌骨肌并暴露气管，从气管右侧分离颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）、颈内动脉（ICA）、枕动脉；结扎枕动脉，分离颈内动脉（ICA）及颅外分支翼腭动脉。在ECA下穿线两根，线一离CCA分叉处3 mm结扎不剪断，线二不打结以供牵拉备用；动脉夹分别夹闭CCA、ICA，于两线之间的ECA剪一切口，将栓子由此口插入，松开ICA上动脉夹，栓子分别经CCA分叉处、ICA、大脑前动脉（ACA），终至大脑中动脉（MCA），以阻断MCA血流。自ICA起始部算，栓子插入深度约为18~20 mm。用线一结扎固定栓子后，松开CCA上的动脉夹；缝合肌肉和皮肤（腹腔注射青霉素，4万单位/只，预防术后感染），动物回笼饲养，保持大鼠肛温37.5 ℃[1，3，5~11]。见图1。

    改良方法制作模型（改良组）：大鼠麻醉，于颈正中偏右2 mm切开，沿胸骨乳突肌和胸骨舌骨肌肌间隙钝性分离出右侧CCA，再分离出右侧ECA，穿线后轻轻提起，分离ICA和枕动脉；烧灼法离断枕动脉，在ECA下穿线2根，线一离CCA分叉处3 mm结扎不剪断，线二不打结以供牵拉备用；动脉夹夹闭CCA、ICA。于2根线之间的ECA剪一切口，将栓子由此口插入，进入ICA约5 mm，轻轻提起CCA上动脉夹并往鼠尾方向稍牵拉，用显微镊轻轻往鼠头方向拨动ICA，栓子继续前行至MCA。余操作步骤同传统方法。

    　　手术操作采用1只传统组大鼠完成后接着1只改良组大鼠，如此依次循环。

    1.3  观察指标

    1.3.1  动物模型神经功能评分  制模成功的标准是动物出现明确的右侧大脑中动脉缺血的神经功能症状，按Longa 的 5 分法进行评判，两组动物模型的分值。0分(0级):无神经功能缺损症状；1分(Ⅰ级):轻度局灶性神经功能缺损，即提尾悬空不能伸展左侧前爪；2 分(Ⅱ级):中度局灶性神经功能缺损，即行走向左侧转圈；3 分(Ⅲ级):中度局灶性神经功能缺损，即行走困难，并向左侧倾倒；4 分(Ⅳ级):不能自发行走，无意识或昏迷。0级、Ⅳ级为模型失败，Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级为模型成功[1，3]，以Ⅱ级、Ⅲ级占成功模型的百分率来评价模型稳定性[12]。

    1.3.2  动物模型制作成功率  计算并比较改良组和传统组存活动物中模型制作成功率和实验动物中模型制作成功率。

    1.3.3  动物模型稳定性  计算并比较改良组和传统组成功模型中II、Ⅲ级所占成功模型的百分率[12]。

    1.3.4  动物模型制作手术操作时间  计算并比较改良组和传统组所用手术操作时间。手术时间从麻醉、固定后颈部剃毛开始计时至缝合皮肤为止。

    1.4  统计学处理

    　　实验数据采用SPSS11.5 进行χ2检验及t检验处理。

    2  结果

    2.1  动物模型神经功能级别分布情况

    　　手术完成后，对改良组和传统组存活的动物模型进行了神经功能评分，分值分布情况见表1。其中，麻醉意外死亡的大鼠随后补足，使各组开始进入手术的大鼠均为30只。传统方法组7只死于术中，改良方法组3只死于术中。

    2.2  动物模型神经功能评分比较

    表1  两组动物模型神经功能级别分值分布情况传统方法组动物模型神经功能评分为（1.96±1.15）分；改良组为（2.70±0.67）分。实验结果表明：改良组明显提高模型动物的神经功能评分，与传统组比较P＜0.01。

    2.3  存活动物模型制作成功率比较

    　　实验结果表明，改良组明显提高存活动物的模型制作成功率，与传统组比较P＜0.05。见表2。

    2.4  实验动物模型制作成功率比较

    　实验结果表明，改良组明显提高实验动物的模型制作成功率，与传统组比较P＜0.05。见表2。表2  两组动物模型制作成功率比较（1）与传统组比较，P＜0.05

    2.5  动物模型成功稳定性比较[12]

    　实验结果表明，改良组明显提高动物的成功模型稳定性，与传统组比较P＜0.05。见表3。表3  两组动物模型成功稳定性比较

    2.6  动物模型制作手术操作时间比较

    　　传统方法组动物模型制作手术操作时间为(39.40±5.40)min；改良组为(27.70±9.30)min。实验结果表明，改良组明显缩短模型制作操作时间，与传统组比较P＜0.01。

    3  讨论

    　　实验性动物脑缺血损伤模型较多，但国内外学者大多认为，线栓大鼠大脑中动脉缺血模型与人脑缺血病理生理改变最为接近，故为国内外所广泛采用，但其手术成功率不高且稳定性较差为其缺憾[1，13，14]。本实验对传统的线栓大鼠大脑中动脉缺血模型制作进行了改良，实验结果与传统方法相比较：(1)改良方法明显提高模型动物的神经功能评分，该法制作的模型动物，较传统方法出现的动物右侧大脑中动脉缺血的神经功能症状更为明确；(2)改良方法明显提高存活动物的模型制作成功率，该法制作的模型动物，不仅存活率高，且符合模型制作成功标准(Ⅰ、Ⅲ级)的动物数增多，较传统方法提高了13.69个百分点；(3)改良方法明显提高实验动物的模型制作成功率，该法制作的模型动物，不仅存活率高，且符合模型制作成功标准(Ⅰ~Ⅲ级)的动物数增多，较传统方法提高了23.34个百分点；(4)改良方法明显提高动物的模型成功稳定性，该法制作的模型动物，符合模型制作成功稳定性标准(Ⅱ~Ⅲ级)的动物数增多，较传统方法提高了18.63个百分点；(5)改良方法明显缩短动物模型制作的手术操作时间，该法制作的模型动物，较传统方法每个动物少用11.70 min。

    体会：（1）传统操作中多采用颈正中切口，撕裂胸骨舌骨肌并暴露气管，从气管右侧分离CCA。本实验采取颈正中线偏右2~3 mm的切口，钝性分离胸骨舌骨肌、胸骨乳突肌乃至CCA，效果更好。因为，其对胸骨舌骨肌、胸骨乳突肌损伤较小，有利于术后大鼠的恢复；其次，不用暴露气管，尽可能减少了术中对气管的损伤；再者，从肌肉的间隙中寻找CCA，减少了小血管的撕裂出血及神经受损的机会；（2）在分离ECA、ICA操作中，因枕动脉从近CCA分叉处始发，同时和ICA平行并有动脉鞘及神经在周围伴绕。本实验分离出ECA，穿线，提线牵拉ECA而分离ICA和枕动脉，操作简便，且大大降低CCA分叉处及周围的出血，并减少对神经损伤的机会；（3）传统操作中多采用分离并结扎方法处理枕动脉，本实验用烧灼法离断枕动脉，既省时又可降低出血的几率；（4）传统操作采用直视法插入栓子，即分离翼腭动脉和MCA后，在直视下将栓子插入MCA。本实验采用盲插法，不需分离翼腭动脉和MCA，一方面可大大节省制模的操作时间，另一方面还可减少因分离翼腭动脉和MCA而对血管和神经造成损伤。

    　　综上所述，本实验对线栓大鼠大脑中动脉缺血模型制作方法的改进，减少了术后动物死亡率，提高了模型制作成功率，提高了模型制作稳定性，缩短了模型制作的操作时间。

【】
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