用改良CTAB法从吴茱萸不同组织提取基因组DNA
作者：刘杨， 黄海， 陶建蜀， 李军
【关键词】 吴茱萸; 基因组，植物； 序列分析，DNA
吴茱萸是我国传统常用中药材，为芸香科植物吴茱萸Evodia rutaecarpa(Juss.) Benth.、石虎Evodia rutaecarpa(Juss.) Benth.var.officinalis (Dode) Huang和疏毛吴茱萸Evodia rutaecarpa(Juss.)Benth.var.bodinieri(Dode)Huang的干燥近成熟果实[1]。贵州省的吴茱萸质量较优，为贵州道地药材，也为贵州名药之一[2]。近代研究证明，其具有镇痛、镇静、抗菌、降压、耐缺氧等药理作用。植物的核基因组的内转录间隔区（internal transcribed spacer,ITS）序列是核基因组中进化较快且序列相对保守的DNA片段，已成为系统与进化研究中的重要分子标记，同时在药用植物的鉴定及道地性方面得到广泛应用[3~5]。吴茱萸品种复杂，不同品种间市场价格差异甚大，种苗在春天落叶后很难区分，传统的分类方法不易鉴别，若建立分子生物学分类方法，得到高质量的DNA是这一技术的的关键。2008年3月开始从吴茱萸的叶和嫩枝中提取基因组DNA，为进行ITS序列测定提供条件。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料 来源于铜仁地区石阡县的石虎吴茱萸及遵义市余庆吴茱萸种植基地的疏毛和大花吴茱萸，均采集新鲜嫩叶及嫩枝，采用干冰保存带回，存于-80 ℃超低温冰箱。
1.1.2 试剂 2倍溴化十六烷基三甲基铵（CTAB）提取缓冲液(100 mmol/L Tris-HCl (pH8.0)，20 mmol/L EDTA (pH8.0)，1.4 mol/L NaCl)，PVP，β-巯基乙醇，10% SDS，蛋白酶K，氯仿∶异戊醇（24∶1），RNase，3mol/L NaAC。
1.1.3 仪器 梯度PCR扩增仪(德国Eppendorf 5330型)，TGL-16B高速离心机(上海安亭仪器厂)，DYY-3A型电泳仪(北京六一仪器厂)，凝胶成像系统(美国BIO-RAD公司)。
1.2 方法
分别将新鲜冷冻的嫩叶、枝约0.1 g放入已高温灭菌并冷冻过的研钵中，倒入液氮，同时加入适量PVP粉末，研磨成粉末状，移入1.5 ml离心管中，离心管中预先加入650 μl 60 ℃预热的2倍CTAB抽提缓冲液（内含20 μl β-巯基乙醇，现用现加），35 μl 10%SDS和20 μl 20 %蛋白酶K，颠倒混匀后60 ℃恒温水浴箱温浴2 h，其间每隔20 min颠倒混匀1次。冷却至室温后加相同体积的氯仿∶异戊醇（24∶1），颠倒混匀，至乳浊状后10 000/min离心10 min，吸取上清液置另一干净1.5 ml离心管中，用氯仿-异戊醇（24∶1）抽提2次，每次抽提时间均不少于20 min。取上清液，加10 μl RNase，室温下静置30 min。加1/10体积的醋酸钠，颠倒混匀后加入2倍体积冰预冷的无水乙醇，轻微晃动至出现白色絮状沉淀，用剪过的枪头将沉淀吸出，70%乙醇洗涤3次。室温下晾干后加100 μl 1倍TE溶解，-20 ℃保存备用。
1.3 DNA样品检测
1.3.1 紫外分光光度计检测 将所得DNA 样品用TE 稀释20倍，紫外可见光分光光度计(TU-1810)测定DNA 样品的A260 nm和A280 nm，以A260/A280 比值检测核酸纯度。
1.3.2 电泳检测 取3 μl DNA 样品，以0.5倍TBE作电泳缓冲液，在含0.5 mg/L 溴化乙锭( EB) 的0.8%琼脂糖凝胶上恒压100 V 电泳45 min，在凝胶成像系统照相观察，检测DNA 样品完整性。
1.3.3 DNA质量检测 根据[6]设计引物，扩增核基因组的内转录间隔区，引物由上海Sangon公司合成。引物1∶5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’；引物2∶5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。
PCR扩增体系：5 μl的10倍buffer(含25 mmol/L MgCl2)；4 μl的2.5 mmol/L dNTP；1 μl的20 μmol/L引物1；1 μl的20 μmol/L的引物2；模板DNA200 μg/L；Taq DNA聚合酶2 U；ddH2O加至50 μl。95 ℃预变性5 min，95 ℃变性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，循环35次，72 ℃最后一次延伸10 min。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定成像，恒压100 V，电泳30 min。
2 结果
2.1 紫外分光光度法检测结果
从表1 可以看出,经紫外分光光度计测定，从3种样品的嫩叶中提取的DNA，在260 nm处与280 nm处吸光度的比值为1.7~1.9，纯度较高，而嫩树枝中提取的DNA比值为1.3~1.5，含量也较少，说明存在蛋白质等的污染。表1 吴茱萸不同样品、不同组织提取的DNA吸光度的比较
2.2 琼脂糖凝胶电泳结果
见图1。 所提的DNA均﹥15 kb，条带清晰，亮度均一，点样孔无残留，均无脱尾现象。
2.3 PCR扩增结果
见图2。在750 bp处均可见一明亮条带，无杂带，与预期扩增的片段大小一致，嫩树枝中的DNA含量虽低于叶中的，但仍扩增出所需的目的条带，说明其质量已完全满足实验要求。注：1~3为嫩叶中DNA的扩增片段；4~6为嫩树枝中
3 讨论
从吴茱萸中获得高质量的基因组DNA是对其进行分子生物学研究的重要前提。但因多糖、酚等次生物质的存在而影响了DNA的提取质量，所以如何有效去除这些物质也是基因组DNA提取的关键。沈颖等[7]提取方法并略作改进。
首先是材料的处理，因吴茱萸叶片柔软，从超低温冰箱取出后容易褐变，在研磨时一定要使材料处于低温状态，而且所用研钵应是预先在-20 ℃冰箱冷冻过夜或研磨前先将液氮倒入研钵，待其彻底冷却后再放入材料。在研磨过程中，确保不要让液氮挥发干净使材料回温，否则会造成DNA的严重降解。同时在研磨过程中加入适量PVP粉末，因它属于还原性物质，可以防止多酚类物质氧化，有效减少褐变。其次是多糖、蛋白质及其他杂质的处理，CTAB是一种去污剂，既能溶解细胞膜，又能较好去除多糖的干扰。在加入CTAB缓冲液进行温浴时，将时间延长至2 h，所获得DNA的质量较高。用氯仿-异戊醇抽提3次，每次抽提时间均不少于20 min，去除蛋白质的效果甚佳。用无水乙醇沉淀后无需离心，即可得到较多气泡的絮状DNA沉淀，也尝试用异丙醇沉淀，但效果略差。用剪过的枪头将沉淀吸出，而不采用离心的办法，可减少沉淀中的杂质，70%乙醇洗涤沉淀3次，可把沉淀中可能含有的杂质去除。
在实验中发现，从新鲜嫩叶中提取的DNA要优于嫩枝的，同时也尝试从老叶和一般树枝中提取，结果除得到的沉淀颜色较深外，DNA含量还低，而且有不同程度的降解，所以倾向于嫩叶和枝。通过对ITS序列的扩增也看出，尽管从嫩枝中得到的DNA含量略低，但仍可获得清晰透亮的目的条带，为吴茱萸种苗在冬季落叶后至来年发芽前这段时间进行分子生物学鉴定，尤其是对种苗进行鉴定，提供了技术保障。
总之，本实验中的改良CTAB法是一种简便、快捷的DNA提取方法，可为全年不同时期对吴茱萸进行分子生物学分类。
【参考】
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].一部.北京：化学出版社, 2005：118.
[2]傅文卫.贵州道地药材吴茱英的研究——微星元素与药材的道地性[J].贵州中医学院学报，1995(3):1-13.
[3]Baldwin B G, Sanderson M J, Porter JM, et al. The ITS region of nuclear ribosomal DNA: A valuable source of evidence on angiosperm phylogeny [J].Ann Missouri Bot Gard, 1995(82):247-227.
[4]Ainouche ML, Bayer RJ.On the origins of the tetraploid Bromus species (section Bromus, Poaceae): insights from internal transcribed spacer sequences of nuclear ribosomal DNA［J］. Genome , 1997(5):730-743.
[5]苏雪,孙坤,张建清,等.DNA 序列分析在药用植物鉴定中的应用［J］．西北师范大学学报(版),2006(4):79-86.
[6]White TJ, Bruns T, Lee S, et al, Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics［M］//Innis M, Gelfand D, Sninsky J，et al. PCR Protocols: A Guide to Methods and Application. San Diego, California: Academic Press,1990:315-322.
[7]沈颖.ISSR-PCR在石斛种间鉴别中的应用[J]. 中草药,2005(3): 423-427.
