改良羊水细胞培养技术在产前诊断中的应用

【关键词】  羊水； 细胞培养； 产前诊断； 染色体； 核型分析； 羊水细胞直接培养

羊水细胞培养及染色体制备是产前诊断染色体病的主要手段[1]。由于羊水细胞培养一直存在技术要求高、难度大、培养时间长、易污染、分裂相少等问题，许多医疗单位的产前诊断中仍未能开展羊水细胞检测工作。多年来，世界各地对羊水细胞的培养及其在染色体制片上虽然不断改进，但羊水细胞培养与染色体制片仍有一定难度。近年来针对羊水细胞培养技术进行了探索和改良，对孕18~24 W孕妇，实施羊膜腔穿刺术抽取羊水，将羊水细胞液直接作用于培养瓶底部进行培养[2]。此改良羊水细胞培养技术，可减少细胞大量丢失，获得有效地细胞克隆，大大提高培养成功率，现报告如下。

    1  资料与方法

    1.1  资料来源

    2004-2007年，100例经产前筛查提示高危者和遗传咨询门诊的有不良妊产史的孕妇，年龄26～40岁，孕周18～24 W，在孕妇知情同意后实施羊膜腔穿刺术。

    1.2  方法

    1.2.1  羊水采集方法  B超引导定位，无菌条件下，采用7号腰穿针穿刺。最先用5 ml注射器抽取2 ml羊水弃去，再换10 ml注射器抽取羊水共30 ml，分别注入一次性无菌离心管中。

    　1.2.2  改良羊水细胞直接培养  以1 000 r/min离心8 min弃去上清液, 保留每管0.5 ml羊水细胞层, 以滴管打匀, 分别接种于50 ml培养瓶底部,拧紧瓶盖放置超净工作台中静止30 min，再沿培养瓶边缘缓缓加入4 ml羊水培养液，使其覆盖细胞悬液，并拧紧瓶盖置于37 ℃恒温培养箱中培养。6 d后，更换培养液并在倒置显微镜下观察细胞生长情况。镜下可见培养瓶底有若干较好的梭形细胞，继续培养并每天观察。2～3 d后，小堆细胞已长成大的克隆，并出现成对圆形透亮细胞时，即可进行细胞收获。若贴壁细胞生长缓慢，可弃掉培养瓶中的液体，加入新鲜的培养液继续培养，直到贴壁细胞生长良好为止。平均在培养后9～11 d进行细胞收获，终止前4 h加入秋水仙素25 g/L 1滴, 最终浓度为50 g/L或加入秋水仙素12.5 g/L一滴，最终浓度为25 g/L，处理15 h，使细胞停止在分裂相中期。在倒置显微镜下可见许多分裂相细胞核，细胞圆而大，相互联接。

    1.2.3  严重血性羊水的处理  羊水标本中渗有少量红细胞不需处理，如遇到严重血性羊水，立即在羊水中加入无菌肝素1滴或以1 000 r/min，离心8 min后，吸取上清液及沉淀液表层于无菌离心管，形成0.5 ml羊水细胞悬液，以备接种使用。换液时，需摇动培养瓶，倒出液体加入等量培养基。

    1.2.4  羊水细胞收获  收获时将细胞刮沿培养瓶底轻轻刮下克隆细胞，利用倒置显微镜可观察克隆细胞已经漂浮起，吸入离心管。再用75%生理盐水冲洗，使其完全脱落后，以1 000 r/min，离心8 min，吸取上清液，留0.5 ml悬液备用。

    1.2.5  低渗  在0.5 ml悬液管中加入已置37 ℃预温的75 %KCl低渗液3 ml，并用手指轻弹管锥或用滴管轻轻吸打，使其混匀，置37 ℃水浴箱中低渗5 min后。以1 000 r/min，离心8 min，吸取上清液，留0.5 ml悬液沿管壁滴入新鲜配置的固定液（甲醇∶冰醋酸 3∶1）4 ml，用手指轻弹管锥或用滴管轻轻吸打，使细胞均匀分开，2次固定60 min后冰箱过夜。

    1.2.6  显带  常规制片，80 ℃烤片3 h，胰酶消化，G显带染色。按照人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN1995)标准进行核型分析诊断。常规计数15个，分析3个分散良好的细胞核型，异常核型的要计数30个分裂相。

    2  结果

    2.1  100例孕妇的羊水细胞培养，1次性羊水穿刺培养成功93例，2次羊水穿刺成功4例，总成功率为97 %。培养收获时间大多数为9~12 d，最短收获为9 d，最长13 d。

    2.2  超过35岁高龄孕妇36例，占总数36%；产前筛查高危42例，占总数42%；有不良妊产史17例，占总数17%；TORCH病毒阳性3例，占总数3%；夫妻一方为平衡易位携带者2例，占总数2%。

    2.3  在培养成功的97例中，染色体正常核型93例，异常核型3例。异常检出率3.09 %，其中1例为47，XY，+21，行引产术；1例为46，XY，-15+t（15q→15p∶22p→22q），行引产术；1例为45，X，+21/46，XY。

    3  讨论

    3.1  改良羊水细胞培养

    影响羊水细胞培养成功率的因素很多[2]。高质量的羊水细胞培养及收获技术是进行羊水染色体分析诊断的关键。因此，在改良羊水细胞直接培养技术方面注重了孕周的选择、种植的技术、培养的环境及收获时间。（1）通过羊水采集培养发现孕周小于18 W的羊水，其中脱落细胞较少，贴壁的羊水细胞相对更少。而大于25 W的羊水中有形成分增多，严重地影响了活细胞的贴壁。因此，确定羊水最佳采集时间在孕18~24 W，此时羊水细胞为生长旺盛期，形成的圆形、双圆形细胞较多，成功率较高。（2）在无CO2培养箱的情况下，根据羊水脱落细胞少，制取过程易丢失的情况，改良原来的种植方法，采取将羊水细胞悬液直接滴于培养瓶底部，经过短暂静止后再加入培养基进行培养，使细胞分布相对集中，减少了细胞大量丢失，并获得更多地有效的细胞克隆，使羊水染色体培养成功率达到97%[3,4]；由一个视野3~4个克隆，增加到6~7个克隆；由14 d培养缩短到5~7 d，克隆细胞增多，培养时间缩短，是此方法最大的优势。

    3.2  建立收获标准

    收获时机的把握是能否制得良好核型玻片的关键。羊水细胞的贴壁时间均为5～7 d，开始贴壁多见胎儿上皮样细胞及梭长形羊水细胞（AF细胞），形成的细胞克隆覆盖1个或1个以上的完整视野；换液后成纤维细胞大片生长，当培养瓶中有2～3个以上细胞克隆, 且每个细胞克隆中存在有20个以上的圆形、3~4个双圆形或葡萄状透亮细胞，细胞克隆中央的细胞开始老化, 克隆周边细胞生长旺盛，为最佳收获时机。

　　3.3  选择合适的收获方法

    收获时采用细胞刮轻轻刮下细胞，置离心管中,避免因采用胰蛋白酶消化浓度难掌握、易消化过的弊端。秋水仙素的用量：用秋水仙素捕获中期细胞，可以采用量大些，处理时间短一些，也可采用量小些，处理时间长些，我们用浓度25 g/L加1滴，处理4 h，或用浓度12.5 g/L 1滴，处理15 h，根据细胞生长情况决定。低渗时间：低渗液采用0.75 ％KCl，处理时间必须恰当，如处理时间不够，染色体仍聚在一起；处理过长，染色体又太分散, 我们采用37 ℃水浴低渗5 min, 效果很好。低渗结束前的离心速度勿太快，以免染色体过于分散, 一般控制在1 000 r/min，离心8 min。染色体片固定时间：固定时间长一点好，可以去掉胞浆，使片子背景透明，利于显带操作,我们采用2次固定60 min后过夜，片子效果更好。

    3.4  关于血性羊水处理

    在行羊膜腔穿刺术中难免羊水受血细胞污染，由于混入大量的红细胞，严重的影响了成活羊水细胞的贴壁[5,6]。我们采用在血性羊水中加1滴肝素，以避免红细胞把羊水细胞凝集起来, 影响羊水细胞贴壁生长；也可吸取上层分离液对羊水细胞进行培养，并结合提前换液及多次换液的方法，使细胞生长良好，培养成功率高。本文中有4例为血性羊水标本，经过上述方法的培养、制备，均得到可用于分析的染色体分裂相。

    本研究结果显示，此改良羊水细胞培养方法大大增加羊水细胞培养的贴壁机率，缩短羊水细胞培养时间，提高羊水细胞培养的成功率，具有实际应用价值，尤其是基层，值得推广。

【】
  [1]孙明强，许继秀，孙立宁，等.提高羊水细胞培养成功率的方法[J].优生与遗传杂志，2007(15)：6.

[2]刘晓翌，肖晓素，樊尚荣,等.羊水细胞染色体制备方法的研究[J].中国妇产科临床杂志，2004（4）：296-300.

[3]许争锋，胡娅莉，朱瑞芳.高效羊水细胞培养技术在产前诊断中的应用[J].中华妇产科杂志，2006（4）：275.

[4]杜维霞,赵耘,傅颖华,等.简便羊水培养方法及染色体遗传病的产前诊断[J].中国优生与遗传杂志,2004(1):26-27.

[5]剡红民,强荣,陶囡,等.羊水细胞培养技术在产前诊断的应用[J].实用医技杂志，2006(23):35-37.

[6]周玉春,黄定梅,雷花香,等.一种改良的羊水细胞染色体制备方法[J].中国优生与遗传杂志，2003(2):11-12.