太子健Ⅱ煎剂对哮喘模型豚鼠嗜酸性粒细胞及内皮素1的影响
【摘要】 目的 观察太子健Ⅱ煎剂对哮喘模型豚鼠支气管壁内的嗜酸性粒细胞(EOS)及内皮素1(ET?1)的影响，探讨太子健Ⅱ煎剂抗小儿哮喘复发的作用机制。方法 将50只豚鼠随机分为5组，正常对照组、哮喘模型组、地塞米松组、高、低剂量太子健Ⅱ煎剂组，卵白蛋白致敏并成功诱喘，分别灌服生理盐水、地塞米松、高、低剂量太子健Ⅱ煎剂，连续15 d。用计数板计数豚鼠血、支气管肺泡灌洗液(BALF)、支气管壁内的EOS数，放免法检测BALF中ET?1含量。结果 与哮喘模型组比较，太子健Ⅱ煎剂高剂量组能减少BALF及支气管壁内EOS的数量(P<0.05)，降低BALF中ET?1的水平(P<0.01)。结论 太子健Ⅱ煎剂可能通过减轻EOS浸润、ET?1产生，减轻气道的慢性炎症。
【关键词】 哮喘; 太子健Ⅱ煎剂; 豚鼠; 动物，实验; 嗜酸细胞; 内皮素缩血管肽类
【Abstract】 Objective To observe the effect of TaizijianⅡ decoction(TZJⅡ) on EOS and ET?1 of guinea pig asthma models.To explore the mechanism of TZJⅡ on anti?relapsing children asthma.Methods 50 guinea pigs were divided into 5 groups randomly，normal control group，asthma model group，dexamethasone group，high?dose TZJⅡ group and low?dose TZJⅡ group.The five groups were sensitized with ovalbumin，and induced asthma successfully.After that each group were given different preventive and treatments for 15 days.Then the number of eosinophils(EOS) in peripheral blood，bronchoalveolar lavage fluid(BALF) and bronchial wall were counted by counting plate.The content of ET?1 in BALF were measured by radioimmunity methods.Results High?dose TZJⅡ could reduce the number of EOS in BALF and bronchial wall(P<0.05)，lower the ET?1 content in BALF(P<0.01) compared with guinea pig asthma models.Conclusion TZJⅡ can lessen EOS infiltration and regulate ET?1 production，suggesting that it might take effect in alleviating the chronic airway inflammation.
【Key words】 Asthma; TaizijianⅡdecoction; Guinea pig; Animal, experiment; Eosinophils; Endothelin
支气管哮喘是小儿最常见的慢性疾病之一，其发病率和死亡率在全球范围内呈逐年上升趋势。据2000年全国儿童哮喘防治协作组调查结果显示[1],国内0～15岁儿童哮喘患病率为1.97%，2年现患率为1.54%，较10年前上升了64.8%。哮喘反复发作，严重影响患儿的生长发育和身心健康。虽然小剂量激素长期吸入是目前抗复发的主要方法，但有报道显示，长期吸入激素也可出现激素依赖和抑制免疫系统功能，进而诱发或加重感染,甚至影响小儿的生长发育[2，3]。
支气管哮喘是一种有免疫功能紊乱的全身变态反应性疾病。免疫分子生物学的深入研究发现，哮喘反复发作与气道的慢性非特异性炎症、气道高反应性、全身免疫及内分泌功能紊乱等密切相关，多种免疫细胞、炎症介质及细胞因子参与了慢性炎症的发生、过程[4]。因此哮喘是一种全身疾病，气道炎症仅仅是其中的一种局部表现，吸入激素只注重了局部抗炎治疗而疏忽了全身的调整。而中医中药在小儿哮喘抗复发的治疗中，通过改善患儿的体质，调节其免疫功能，发挥整体治疗的优势，从而达到防治哮喘复发的目的，具有减少复发、改善临床症状快、毒副反应少等优点。俞景茂教授在长期的临床实践中，根据小儿的生理病理特点，运用“和法”，采用经验方——太子健Ⅱ方，抗小儿哮喘复发具有显著疗效。本实验旨在探讨该方防治哮喘复发的可能机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物 健康DHP幼年豚鼠50只，雌雄各半，体质量(235±34)g。由浙江大学医学院动物实验中心提供，动物合格证号：浙医动字20000710。
1.2 试剂与药品 (1)内皮素1(ET?1)放免试剂盒(北京东雅生物技术研究所，批号：20001101);(2)太子健Ⅱ煎剂：太子健Ⅱ方中药物(柴胡、黄芩、法半夏、丹参、太子参、菟丝子、象贝、蝉衣、炙甘草、红枣等)均由浙江中医药大学附属第一中药房提供。药汁浓缩成生药2 g/mL和1 g/mL两种浓度，分装入已消毒的瓶中，密封后再高温灭菌，置冰箱保存备用;(3)地塞米松磷酸钠注射液1 mL：5 mg/支(江苏方强制药厂，批号：991024)。以生理盐水配成0.2 g/L溶液备用;(4)卵蛋白片：由上海化学试剂站提供，批号F981130。
1.3 实验仪器 (1)402超声雾化器(上海四菱医疗器械厂);(2)SN?695型智能放免γ测量仪(上海原子核研究所日环仪器一厂)。
1.4 实验方法
1.4.1 动物分组 将豚鼠按随机数字表法分成5组，正常对照组、哮喘模型组、太子健Ⅱ煎剂高剂量组、太子健Ⅱ煎剂低剂量组和地塞米松组，每组各10只。
1.4.2 动物模型的制备 参照[5]，75%乙醇溶液消毒局部皮肤后，给哮喘模型组、太子健Ⅱ煎剂高、低剂量组及地塞米松组每只豚鼠腹腔注射10%卵蛋白生理盐水溶液1 mL致敏，第15天将致敏豚鼠置于4 L的玻璃钟罩内，给予超声雾化吸入1%卵蛋白生理盐水溶液激发，每次雾化15 s，并在雾室中放置至哮喘发作，即为造模成功。隔天雾化1次，共5次。如豚鼠出现抽搐，马上将其取出，必要时做人工呼吸，防止豚鼠死亡。正常对照组用生理盐水1 mL代替抗原液腹腔注射，第15天起隔天予超声雾化吸入等容积的生理盐水。
1.4.3 干预方法 致敏第8天起，正常对照组及哮喘模型组予生理盐水2 mL灌胃，太子健Ⅱ煎剂高剂量组按生药20 g/(kg·d)(10 mL/(kg·d)，200%太子健无菌溶液)灌胃，太子健Ⅱ煎剂低剂量组按生药10 g/(kg·d)(10 mL/(kg·d)，100%太子健无菌溶液)灌胃，地塞米松组给予地塞米松1 mg/(kg·d)灌胃。每日1次，连续给药15 d。
1.5 观测指标
1.5.1 血液及支气管肺泡灌洗液(BALF)中嗜酸性粒细胞(EOS)计数 末次抗原激发后，以2%戊巴比妥钠50 mg/kg的剂量腹腔注射麻醉豚鼠，摘眼球取血5 mL后，剪开胸腔，分离出气管，剪开气管，用适宜的导管经气管插管并结扎固定，缓慢向导管内注入无菌生理盐水7 mL，保留30 s后轻轻回抽，反复灌洗3次，将所得的BALF定量后离心(1 500 r/min，离心10 min)，收集上清液，置-70 ℃低温冰箱中保存。取乙醇伊红稀释液0.38 mL于小试管内，分别加入血及BALF 20 μL，立即轻轻混合均匀，充分混匀充入双侧计数池内，静置2～5 min。低倍镜下计数10个大方格(两侧计数池的中央和四角的大方格)内EOS数，再根据公式：10个大方格内EOS数×20，求出每微升EOS数。
1.5.2 BALF中ET?1的检测 取离心后的BALF上清液，采用放射免疫分析法测定ET?1。具体操作均严格按试剂盒说明书进行。
1.5.3 肺组织EOS浸润程度 剪取每只豚鼠左肺下叶组织，浸泡于10%甲醛溶液中固定，常规脱水，石蜡包埋切片，HE染色。光镜下观察支气管、肺泡等组织形态变化及EOS等炎性细胞的浸润程度。并参照文献[6]，高倍镜下，随机选取5个支气管，数支气管壁内的EOS个数(不包括管腔内及管周的EOS)，以支气管壁的周长为单位(细胞个数/100 μm)计数EOS数量，然后求其平均数。
1.6 统计学方法 计量资料以±s表示。多组间均数比较采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。使用SPSS 12.0统计软件进行统计处理。
2 结果
2.1 太子健Ⅱ煎剂对哮喘豚鼠一般情况的影响 豚鼠诱喘后普遍出现精神较差，拱背群聚，反应迟钝，活动及饮食减少等表现，而太子健Ⅱ煎剂观察组较其他两组恢复快。第1次及第4次诱喘时，哮喘模型组有2只豚鼠，太子健Ⅱ煎剂低剂量组有1只豚鼠诱喘后哮喘严重发作而死亡。
2.2 太子健Ⅱ煎剂对BALF中ET?1的影响 见表1。表1 太子健Ⅱ煎剂对BALF中ET?1的影响注：与正常对照组比较，aP<0.05，bP<0.001;与哮喘模型组比较，cP<0.01，dP<0.001;与地塞米松组比较，eP<0.05。
表1结果表明：哮喘时ET?1明显升高;地塞米松能明显抑制ET?1的升高;太子健Ⅱ煎剂高剂量组、太子健Ⅱ煎剂低剂量组均能抑制ET?1升高，但作用较地塞米松组弱。
2.3 太子健Ⅱ煎剂对哮喘豚鼠血液、BALF及支气管壁内EOS数的影响 见表2。表2 太子健Ⅱ煎剂对哮喘豚鼠血液、BALF及支气管壁内EOS数的影响注：与正常对照组比较，aP<0.001;与哮喘模型组比较，bP<0.05，cP<0.01，dP<0.001;与地塞米松组比较，eP<0.05，fP<0.01。
表2说明过敏性哮喘时，无论在外周血中还是局部气道内EOS均明显增加;地塞米松能显著降低EOS;太子健Ⅱ煎剂高剂量组能显著降低气道局部的EOS量;太子健Ⅱ煎剂低剂量组对EOS作用不明显。
3 讨论
哮喘是气道慢性变态反应性炎症，其基本病理生理变化是EOS的浸润，EOS尤其是低密度嗜酸性粒细胞是气道炎症中的主要效应细胞，与晚期哮喘反应和气道高反应性关系密切。EOS被激活可产生白三烯和血小板活化因子等炎性介质，还可引起肥大细胞释放组胺和趋化因子，并建立自身维持环，吸引更多EOS聚集到反应部位，从而形成一种周而复始的持续炎症反应，并进一步释放主要碱基蛋白、嗜酸性粒细胞阳离子蛋白、血小板活化因子和缓激肽，对上皮细胞发生毒性作用，导致上皮损伤、支气管痉挛、黏液分泌增多，且EOS在哮喘缓解期仍处于高水平[7]。本实验结果表明，太子健Ⅱ煎剂能显著降低气道局部的EOS数，直接抑制EOS在气道内的浸润，减轻了EOS所释放的毒性蛋白对气道上皮和肺组织的损伤，从而减轻气道的慢性炎症及降低气道的高反应性。ET，尤其是ET?1，是哮喘发病过程中的重要炎性介质。ET?1不仅加剧平滑肌的收缩，还提高了气道平滑肌自身收缩反应性，并导致因气道细胞异常增殖引起的气道重建。它能增加血管通透性，促进炎症细胞向气道内聚集，损伤气道上皮细胞，在气道局部形成恶性循环，促进了气道高反应性。目前认为这种机制可能是造成慢性顽固性哮喘难以控制的重要原因[4]。本实验结果表明太子健Ⅱ煎剂能抑制ET?1升高，从而减轻ET?1对气道的损伤及支气管痉挛，改善气道的通气功能。
小儿哮喘反复发作的诱因以感冒居多，大部分哮喘患儿往往又是复感儿，临床常因感冒而出现哮鸣、痰喘、咳嗽等症状。病情时缓时著，时发时止，似有往来不已之势。俞景茂教授认为哮喘缓解期表现为正虚而表未尽，病机为枢机失利，病在少阳，兼及太阳，又由于小儿具有易虚易实、易寒易热的病理特点，不宜峻补，故拟太子健Ⅱ方采用“和法”缓调。太子健Ⅱ方(由柴胡、黄芩、法半夏、丹参、太子参、菟丝子、象贝、蝉衣、炙甘草、红枣等组成)，从小柴胡汤化裁而来。药理研究证实：小柴胡汤具有抗炎、增强免疫、抑制变态反应、促肾上腺皮质激素分泌、抑制血小板凝集等作用[8]。中医认为痰瘀互结是哮喘反复发作的宿根，风邪引动是外因，故加入象贝化痰、丹参活血、蝉衣散风。实验研究证实[9]，丹参能改善哮喘患者长期缺氧造成的微循环障碍，能抗过敏，稳定肥大细胞膜，抑制其脱颗粒和介质释放，抑制浆细胞产生IgE，提高机体IgG及补体C3等作用。哮喘患儿还存在一定程度的肾上腺皮质功能不足，故加入菟丝子温肾助阳，提高皮质激素的水平。全方消补兼施，寒温并用，表里同治，恰合小儿“易寒易热、易虚易实”的病理特点。通过活血化痰消除气道慢性炎症，理气降低气道高反应性，补虚调整机体的免疫功能，祛风抗过敏，风、气、痰、瘀、虚兼顾，发挥整体调节的效应，达到抗哮喘复发的目的。因此，临床运用“和法”抗小儿哮喘复发符合小儿哮喘的发病机制及小儿的生理病理特点，是本病缓解期的基本治则。
本实验主要从抗气道慢性炎症等方面初步探索了太子健Ⅱ煎剂的作用机制。今后仍应需在免疫功能调节、抗感染、抗病毒等方面进行更深入的研究。
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