结直肠癌p16/MTS1基因纯合缺失的研究

【摘要】  目的 探讨p16/MTS1基因结合缺失与结直肠癌的发生及临床病理关系。方法 采用聚合酶链反应方法，对68例结直肠癌组织中p16/MTS1基因纯合缺失进行检测。并用Fisher精确检验的方法,对p16/MTS1基因纯合缺失与临床病理关系进行统计分析。结果 68例结直肠癌组织, p16/MTS1基因纯合缺失率为35.29%。Duckes C、D期的缺失率明显高于Duckes A、B期（P<0.05）。低分化腺癌p16/MTS1基因纯合缺失率（11/16）高于高分化腺癌肿瘤（4/25）（P<0.05）。侵犯到浆膜及浆膜外者p16/MTS1基因纯合缺失率高于侵犯在浆膜内者（P<0.05）。结论 p16/MTS1基因纯合缺失与结直肠癌的临床分期、病理分化、肌层浸润等生物学特征有关。

【关键词】  结直肠癌;p16/MTS1;抑癌基因

    [Abstract]  Objective  To probe the expression of p16/MTS1 gene in colorectal carcinoma.  Methods  Homozygous deletion of p16/MTS1 gene was examined by PCR methods in 68 cases of colorectal carcinoma. Results  35.29% homozygous deletion of p16/MTS1 gene was found in carcinoma of colorectal. The rate of homozygous deletion of p16/MTS1 in Dukes C, D stages was significantly higher than that in Dukes A, B stages（P<0.05）. p16/MTS1 gene homozygous deletion was higher in poorly differentiated carcinoma than that in well differentiated carcinoma. Conclusion  There is a relationship between homozygous deletion of p16/MTS1 gene and clinicalpathological features of colorectal carcinoma.

    [Key words]  Colorectal carcinoma; p16/MTS; 1 Suppressed gene

    结直肠癌是消化道常见的恶性肿瘤之一，就全球而言，发病率和死亡率呈上升趋势。据世界卫生组织Parkin博士的报道，2002年结直肠癌新病例102.3万，死亡52.9万，其发病率和死亡率分别居所有癌症的第三位和第四位。在现有2460万癌症患者中，结直肠癌占11.4％，仅次于乳腺癌居第二位[1,2] 。在我国, 南方发病率高于北方,广东、上海、江浙一带为高发区, 近年来由于、生活水平提高以及饮食结构的改变, 结直肠癌的发病率一直呈上升趋势, 为人们所关注。最近据WHO报道的资料，我国结直肠癌死亡率2005年比1991年增加70.7％，年均增加4.71％1 [3]。p16基因是1994年4月报道的多肿瘤抑制基因（Multiple tumorsuppressor/MTS1）, p16/MTS1基因的缺失广泛存在于人类多种原发性肿瘤组织及肿瘤细胞株中。为分析p16/MTS1基因失活与结直肠癌的临床、病理关系，我们对手术切除结直肠癌新鲜组织采用聚合酶反应（PCR）方法，对68例结直肠癌组织进行检测，分析肿瘤组织中p16/MTS1基因纯合缺失情况，以探讨p16/MTS1基因纯合缺失与结直肠癌的发生及临床病理关系。现报告如下。

    1  材料与方法

    1.1  标本  收集我院2003～2006年间手术切除的结直肠癌68例，男37例，女31例；年龄65.8岁。右半结肠癌18例，左半结肠癌25例，直肠癌25例；高分化腺癌25例，中分化腺癌27例，低分化腺癌16例；Dukes分期：A期13例，B期21例，C期28例，D期6例。其中有淋巴转移29例，有肝转移3例。浸润黏膜、黏膜下层9例，浸润到肌层及浆肌层23例，侵犯到浆膜及浆膜外36例。所有标本经组织病诊断证实。

    1.2  方法

    1.2.1  提取DNA  将1 g肿瘤标本剪成碎片，在研磨器中间加少许液氮。研磨2～5 min，加入3～4 mL TNE（含20 mmol/Ltris，100 mmol/NaCl，和50 mmol/L EDTA,pH7.5），小心移入离心管，加入0.1 g/L蛋白酶K，混匀；再加5 g/L SDS。55℃消化3～4 h。酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，干燥后溶于50 ul dd H2O中。

    1.2.2  p16/MTS1基因纯合缺失检测  用PCR法扩增p16/MTS1基因外显子2，同时扩增β?actin作为内对照。引物序列为：上游：5′?GGA AAT TGC AAA CTG GAA GC?3′；下游：5′?TCA TCA GTC CTC ACC TGA G?3′。内对照上游：5′?GAG ACA GGT ACG GCT GTC ATC?3′；下游：5′CCC TTC CTA TGA CAT GAA C?3′。PCR反应循环参数为94℃ 1 min，60℃ 1 min，72℃ 1 min。35个循环后，72℃延伸10 min。PCR产物经2％琼脂糖凝胶电泳，EB染色分析。

    1.3  统计学分析  两资料间差异检验用Fisher精确法检验。应用SPSS软件。

    2  结  果

    2.1  p16/MTS1基因纯合缺失检测结果  对68例患者进行p16/MTS1基因纯合缺失检测，有24例纯合缺失，纯合缺失率为35.29%（24/68）。

    2.2  p16/MTS1基因纯合缺失与临床分期关系  Duckes A期p16/MTS1纯合缺失2例（2/13）;Duckes B期p16/MTS1纯合缺失6例（6/21）；Duckes C期p16/MTS1纯合缺失13例（13/28）；Duckes D期p16/MTS1纯合缺失3例（3/6）。C、D期缺失率高于A、B期（P<0.05）。

    2.3  p16/MTS1基因纯合缺失与肿瘤分化程度关系  高分化腺癌中，p16/MTS1基因纯合缺失4例（4/25）；中分化腺癌p16/MTS1纯合缺失9例（9/27）；低分化腺癌p16/MTS1纯合缺失11例（11/16）。低分化腺癌p16/MTS1基因纯合缺失率高于高分化腺癌肿瘤（P<0.05）。

    2.4  p16/MTS1基因纯合缺失与肌层浸润关系  浸润黏膜、黏膜下p16/MTS1基因纯合缺失0例（0/9），浸润到肌层及浆肌层p16/MTS1基因纯合缺失6例（6/23），侵犯到浆膜及浆膜外p16/MTS1基因纯合缺失18例(18/36)，侵犯到浆膜及浆膜外p16/MTS1基因纯合缺失率高于浸犯到浆膜以内者（P<0.05），见表1。表1  病理因素与p16/MTS1基因纯合缺失关系

    3  讨  论

    3.1  p16/MTS1与肿瘤关系  p16/MTS1基因是1994年4月报道的一种新型的抑癌基因。p16/MTS1直接抑制细胞周期依赖性激酶4（CDK4），可阻断细胞周期进程而抑制癌细胞生长。p16/MTS1基因位于人第9号染色体的p21区域。由于这个部位的缺失、突变、易发生恶性肿瘤。研究发现，来源于黑色素瘤、肺、乳腺、脑、骨、皮肤、膀胱、肾及卵巢等部位的癌细胞系均可出现高频率的p16/MTS1基因纯合缺失，75％的癌细胞株有p16/MTS1基因缺失或突变，超过p53基因的50％突变率[4～6]。在人体肿瘤组织的检测中，同样发现有p16/MTS1基因的异常，包括肺、食管、卵巢、肾、膀胱、乳腺、脑、鼻咽等部位的肿瘤。p16/MTS1基因的缺失可导致肿瘤细胞无限生长。以上事实预示着p16/MTS1基因在肿瘤发生过程中扮演重要角色。

    3.2  p16/MTS1基因纯合缺失与结直肠癌的发生及临床病理关系  我们采用聚合酶链反应（PCR）方法，得出本研究68例结直肠癌标本中p16/MTS1基因纯合缺失率为35.29%（24/68）。本研究中，C、D期病例p16/MTS1基因纯合缺失率高于A、B期（P<0.05），而且B期高于A期。低分化腺癌p16/MTS1基因纯合缺失率68.75%（11/16）明显高于高、中分化腺癌（P<0.05）。侵犯到浆膜及浆膜外者p16/MTS1基因纯合缺失50.00%（18/36）高于侵犯在浆膜以内者（P<0.05）。推测p16/MTS1基因纯合缺失与结直肠癌的临床分期、病理化分、肌层浸润等生物学特征有关。由于本研究病例尚少，有待增加检测病例数量，进一步验证。

【】
  [1]Steward BW, Kleihues P. World Cancer Report[M]. Lyon:IARC Press,2003: 198?202.

[2]Parkin DM,Bray F,Ferlay J,et al.Global Cancer Statistics 2002[J].CA Cancer J Clin, 2005,55:74?108.

[3]郑树.结直肠肿瘤——基础研究与临床实践[M].北京：人民卫生出版社，2006：3?4.

[4]Tobin J. Cammett, Li Luo, Zheng?yu Peng. Design and Characterization of a Hyperstable p16INK4a that Restores Cdk4 Binding Activity when Combined with Oncogenic Mutations[J].Journal of Molecular Biology, 2003,327(1): 285?297.

[5]Peter Muscarella, Junan Li, Masahiro Tsutsumi, et al. Deletional Inactivation of the p16/MTS1 Tumor Suppressor Gene in Hamster Pancreatic Tumors: Analysis by Multiplex Real?Time PCR[J].Journal of Gastrointestinal Surgery,2003,7(2):293.

[6]Anjali Mahajan, Yi Guo, Chunhua Yuan, et al. Dissection of Protein Protein Interaction and CDK4 Inhibition in the Oncogenic versus Tumor Suppressing Functions of Gankyrin and P16[J].Journal of Molecular Biology,2007,373(4):990?1000,